177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的制備及正常鼠體內生物分布

鄧新榮，杜 進，羅志福

1.中國原子能科學研究院 同位素研究所，北京 102413；2.中國同位素有限公司，北京 100045

采用生物素和親和素系統進行腫瘤預定位放射免疫顯像及治療研究已取得令人鼓舞的結果[1-2]。生物素-親和素預定位系統具有信號放大作用，能夠大幅度提高腫瘤/非腫瘤的放射性核素的比值，從而明顯提高診斷的靈敏度[3-4]。

親和素(Avidin)是一種糖蛋白，又稱抗生物素蛋白或抗生物素，由4個相同的、含128 個氨基酸的亞基組成，亞基之間通過二硫鍵連接，每個親和素分子可以結合4個生物素(Biotin)分子[5]。生物素和親和素結合顯示高度的親和性與特異性(親和力Ka=1015L/mol)，它們一旦結合后很難分離。但當生物素或親和素的活性受到損傷時，其結合能力會下降[6-7]。

在腫瘤預定位放射免疫顯像中，先引入親和素化抗體，在體內預先定位于腫瘤，再注入放射性核素標記的生物素，由于生物素-親和素的高特異性結合和標記生物素的快速體內代謝過程，顯著提高了靶比非靶(T/NT)比值，改善了圖像質量，提高了顯像的靈敏度[8-10]。

177Lu具有適宜的物理半衰期(6.7 d)，發射平均能量為133 keV的β-粒子，在組織中的平均射程為670 μm，適合殺死腫瘤組織；同時發射能量為113(6.4%)和208(11.0%) keV的γ射線用于顯像，可監測和指導治療過程，對患者造成的輻射劑量也較少[3]。177Lu較長的半衰期不但為其生產、產品的QA/QC和對遠離核素生產地點的供應提供了方便，還可以減少多次注射給病人帶來的痛苦。177Lu可以通過反應堆輻照生產，其低成本和易得性的特點使其適用于生產放射性藥物[4]。因此，177Lu 是近年來受到廣泛關注的可用于腫瘤治療的放射性核素。177Lu 標記的放射性藥物主要用于治療骨轉移癌疼痛和原發灶癌，其中177Lu-EDTMP(乙二胺四甲撐膦酸)和177Lu-DOTA-TATE(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-奧曲肽衍生物)已經進入臨床研究[11-12]。

本研究旨在采用177Lu標記DTPA-BIS-BIOTIN，優化標記反應條件，并對標記物在正常小鼠體內生物分布進行研究，為進一步采用177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN進行腫瘤預定位顯像及治療研究提供實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與裝置

BP211D型電子天平，德國Sartorius公司，感量為10-5g；AR2000 放射性薄層掃描儀，美國Bioscan公司；Mili-Q超純水系統，美國Millipore公司；RM-905A型活度計，中國計量科學研究院；快速薄層紙層析紙(ITLC-SG)，美國PALL公司；GAMMA C12 γ計數器，美國DPC公司。

1.2 主要材料與試劑

177LuCl3溶液，放射性濃度為1 840 GBq/L，北京原子高科股份有限公司。DTPA-BIS-BIOTIN，美國SIGMA公司產品，其結構示于圖1。醋酸鈉，美國SIGMA公司；醋酸、生理鹽水等其它化學試劑，分析純，北京試劑公司。昆明小白鼠，雄性，18～20 g ，二級，購自北京大學醫學部實驗動物部。

圖1 DTPA-BIS-BIOTIN的化學結構Fig.1 Structrure of DTPA-BIS-BIOTIN

2 實驗方法

2.1 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的制備

在Eppendorf(EP)管中加入15 μL DTPA-BIS-BIOTIN(1.0 g/L，溶于0.2 mol/L NaOAc-HOAc緩沖溶液，pH=4.5)，加入相同醋酸鹽緩沖溶液125 μL，再加入10 μL177LuCl3(18.4 MBq)，混勻，在80 ℃反應8 min，取樣進行快速薄層層析法(ITLC)檢測分析。

用上述類似的標記方法，在其它條件相同的情況下，分別考察不同pH值(3.0、3.8、4.1、4.3和4.5)對標記率的影響，DTPA-BIS-BIOTIN含量分別為5、10、15、20、25 μg時對標記率的影響以及不同反應時間對標記率的影響。

2.2 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的分析

取標記液點樣于ITLC濾紙(10 mm×200 mm)上，以生理鹽水為展開劑，上行展開，晾干后用放射性薄層掃描儀掃描，計算標記率或放射化學純度。

2.3 標記物的體外穩定性

將標記物(放射化學純度大于99%)于室溫放置96 h，并于期間不同時間點取樣，使用ITLC法檢測標記物的放射化學純度。

2.4 標記物在正常小鼠體內生物分布實驗

取體重為18～20 g的正常昆明小鼠30只，隨機分成6組(每組5只)，經尾靜脈注射100 μL177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN(0.3 MBq) ，分別于注射后0.5、1、3、6、24 h斷頭處死，取血及主要臟器，稱重并測量放射性計數，經衰變校正后計算每克組織的百分注射劑量率(%ID/g) 。

3 結果和討論

3.1 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的制備和分析

在以生理鹽水為展開體系的ITLC分析方法中，游離的177Lu3+的Rf=0.0～0.1，177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的Rf=0.8～0.9，本ITLC分析法可用于測定177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的標記率和放射化學純度。

圖2 pH值對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標記率的影響Fig.2 Effect of pH on labeling yield

3.1.1標記反應pH值對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標記率的影響 反應體系pH對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標記率的影響示于圖2。當DTPA-BIS-BIOTIN 10 μg，177LuCl318.4 MBq，80 ℃條件下，標記反應液的pH值分別為3.0、3.8、4.1、4.3和4.5時，反應20 min后177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的標記率分別為72.2%、91.2%、91.1%、92.5%和98.0%。177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的標記率依賴于反應體系的pH值，在pH≈4.5時可獲得較高的標記率。

3.1.2DTPA-BIS-BIOTIN濃度對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標記率的影響 DTPA-BIS-BIOTIN濃度對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標記率的影響結果示于圖3。在加入相同量177LuCl3時，DTPA-BIS-BIOTIN質量分別為5、10、15、20、25 μg時，177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標記率分別為93.5%、95.9%、98.3%、99.1%、99.9%。在DTPA-BIS-BIOTIN質量為20～25 μg時，標記率基本不變，可獲得高放射化學純度的177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN溶液。

圖3 DTPA-BIS-BIOTIN質量對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標記率的影響Fig.3 Effect of mass of DTPA-BIS-BIOTIN on labeling yield

3.1.3反應時間對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標記率的影響 反應時間對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標記率的影響示于圖4。在相同量的DTPA-BIS-BIOTIN和177LuCl3條件下，DTPA-BIS-BIOTIN質量為25 μg、反應溫度為80 ℃時，反應時間為10 min時177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的標記率為98.5%，隨著時間延長到60 min，標記率均可達99.0%以上。

圖4 不同反應時間對177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標記率的影響Fig.4 Effect of reaction time of DTPA-BIS-BIOTIN on labeling yield

3.2 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的體外穩定性

標記物177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN(放射化學純度大于99%)具有良好的體外穩定性，室溫放置24 h穩定，放化純大于99%，放置48 h后放化純為99%，放置96 h后，放射化學純度仍都保持在98%以上。

3.3 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN在小鼠體內的生物分布

177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN在正常小鼠體內分布列于表1。由表1可以看出，經尾靜脈注射后，177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN在小鼠血液中清除迅速，30 min 時血中滯留(0.454±0.115)%ID/g，24 h后幾乎全部代謝。177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN在腎中有較高的攝取，30 min 時腎的攝取為(2.470±0.375)%ID/g，提示177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN主要經腎臟排泄；但在正常組織如肝、脾等有非特異性攝取，這與文獻報道153Sm-DTPA-BIS-BIOTIN在小鼠體內的代謝情況相似[5]。在注射后24 h脛骨攝取為(0.681±0.164)%ID/g，可能是由于經過體內的生物素激酶作用后，177Lu被釋放濃集于骨骼組織的緣故。這與177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN的體內穩定性相關，導致其不穩定的途徑主要有2種：一是在血清中蛋白激酶如生物素激酶作用下使放射性核素從DTPA-BIOTIN復合物上脫落；另一途徑是由于此類放射性核素與雙功能螯合劑結合穩定性高，使雙功能螯合劑與生物素之間的鍵斷裂。對于DTPA-BIS-BIOTIN更傾向標記核素從復合物上脫落[13]，本實驗也得到與文獻中報道類似的結果。

表1 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN在正常小鼠體內分布Table 1 Biodistribution of 177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN in normal mice

注(Note)：n=5

4 結 論

在最佳標記條件下(DTPA-BIS-BIOTIN 25 μg，標記介質pH=4.5，80 ℃反應20 min)，177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN標記率大于99.0%，室溫下放置96 h，標記物體外穩定性良好。正常小鼠體內分布實驗結果表明，177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN在血液中清除快，主要濃集于肝、脾和腎，經腎臟排泄。本研究為進一步采用177Lu-DTPA-BIS-BIOTIN進行腫瘤預定位顯像及治療研究提供了實驗基礎。

致謝：感謝樊彩云、葉肇云等科研人員的幫助。

[1] Lesch H P, Kaikkonen M U, Pikkarainen J T, et al. Avidin-Biotin Technology in Targeted Therapy[J]. Expert Opin Drug Deliv, 2010, 7(5): 551-564.

[2] Boerman O C, van Schaijk F G, Oyen W J G, et al. Pretargeted Radioimmunotherapy of Cancer: Progress Step by Step[J]. J Nucl Med, 2003, 44: 400-411.

[3] Stella M, de Nardi P, Paganelli G, et al. Avidin-Biotin System in Radio Immunoguided Surgery for Colorectal Cancer, Advantages and Limits[J]. Dis Colon Rectum, 1994, 37: 335.

[4] Sharkey R M, Karacay H, Cardillo T M, et al. Improving the Delivery of Radionuclides for Imaging and Therapy of Cancer Using Pretargeting Methods[J]. Clin Cancer Res, 2005(11): 7 109s-7 121s.

[5] Goodwin D A, Meares C F. Pretargeted Peptide Imaging and Therapy[J]. Cancer Biother Radio-pharm, 1999, 14: 145-152.

[6] Goldenberg D M. Targeted Therapy of Cancer With Radiolaleled Antibodies[J]. J Nucl Med, 2002, 43: 693-713.

[7] Rosebrough S F, Hartley D F. Biochemical Modification of Streptavidin and Avidin:inVitroandinVivoAnalysis[J]. J Nucl Med, 1996, 37(8): 1 380-1 384.

[8] Meredith R F, Buchsbaum D J. Pretargeted Radioimmunotherapy[J]. Int J Radiation Oncology Biol Phys, 2006, 66: S57-S59.

[9] Graves S S, Dearstyne E, Lin Y, et al. Combination Therapy With Pretarget CC49 Radioimmunotherapy and Gerncitabine Prolongs Tumor Doubling Time in Amurine Xenograftmod Elofcolon Cancermore Effectively Than Either Monotherapy[J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(10 Pt 1): 3 712-3 721.

[10] Gasparri A, Moro M, Curnis F, et al. Tumor Pretargeting With Avidin Improves the Therapeutic Index of Biotinylated Tumor Necrosis Factor α in Mouse Model[J]. Cancer Research, 1999, 59: 2 917-2 923.

[11] Liepe K, Runge R, Kotzerke J. The Benefit of Bone-Seeking Radiopharmaceuticals in the Treatment of Metastatic Bone Pain[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2005, 31(1): 60-66.

[12] Ando A, Ando I, Tonami N, et al.177Lu-EDTMP: A Potential Therapeutic Bone Agent[J]. Nucl Med Commun, 1998, 19(6): 587-591.

[13] Hainsworth J, Harrison P, Mather S J. Preparation and Characterization of a DOTA-Lysine-Biotin Conjugate as an Effector Molecule for Pretargeted Radionuclide Therapy[J]. Bioconjugate Chem, 2005, 16: 1 468-1 474.