99Tcm標記的小干擾RNA探針的制備及穩定性評價

康 磊，王榮福，*，閆 平，劉 萌，張春麗，于明明，崔永剛，徐小潔

1.北京大學第一醫院 核醫學科，北京 100034；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850

自從1998年Andrew Fire和Craig Mello首次證實了雙鏈RNA分子可誘導同源靶向mRNA降解并導致基因沉默的RNA干擾(RNA interference, RNAi)機制后，RNAi技術已經成為基因功能研究和基因治療研究等領域中最熱門的技術之一。小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)作為RNAi過程中的關鍵因子，具有強大的基因靶向能力和沉默作用。但是siRNA應用于體內研究時卻往往由于脫靶效應或者轉運不良而喪失基因沉默效應，因此迫切需要一種針對siRNA分子的體內示蹤技術、特別是體內顯像技術的應用[1]。放射性核素示蹤技術具有安全可靠、探測靈敏、分辨率高等優點，尤其在大體動物體內顯像較光學成像方法具有很大優勢。構建一種針對siRNA分子的放射性核素標記方法對于RNA分子體內示蹤和RNA反義顯像技術的發展具有重要意義，并且結合siRNA的基因沉默效應可與放射性治療聯合達到基因干擾與放射治療的雙重效果。

另一方面，RNAi技術的迅速發展為提高RNA分子體內穩定性提供了相關技術支持。一直以來RNA分子的不穩定性限制了其在反義核酸研究領域的應用。但是近年來一些化學修飾方式已被成功應用于提高RNA分子的穩定性，包括硫代修飾(phosphorothioate，PS)[2]和2’-甲氧基修飾(2’-O-methyl，2’-OMe)[3]。2’-OMe修飾不但可以提高RNA抵抗多種理化因素和體內多種酶的降解作用，而且還能增加RNA分子的體內轉運能力。本工作采用全程2’-OMe化學修飾，選擇人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)mRNA為作用靶點的siRNA作為標記探針，擬通過偶聯雙功能螯合劑S-乙酰基-NHS-MAG3(N-hydroxysuccinimidyl derivative of S-Acetyl mercaptoacetyltriglycine)構建99Tcm標記的siRNA示蹤探針，并對其體外標記和活性穩定性進行評價，以期將來應用于腫瘤反義顯像和治療研究。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

S-乙酰基-NHS-MAG3由Hnatowich教授(University of Massachusetts Medical School)提供；N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、氯化亞錫(SnCl2·2H2O)、二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide，DMF)均購于美國Sigma-Aldrich公司；酒石酸鈉、乙酸銨、氫氧化銨等常規分析純化學試劑均購于北京化學試劑公司；99Mo-99Tcm發生器，北京原子高科技術股份有限公司；Sephadex G25(細)購于美國GE Amersham公司；焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)購于美國Amresco公司，所有試劑均由DEPC處理過的水配制；肝細胞肝癌腫瘤細胞系HepG2，ATCC來源；高糖DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培養基、轉染試劑Lipofectmine 2000、無血清培養基(Opti-MEM I Reduced Serum Medium)、10%胎牛血清、Trizol均購于美國Invitrogen公司；Turbo Script逆轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒購于原平皓公司；DNA聚合酶購于美國CHIMERx公司；瓊脂糖粉購于法國Biowest公司。

1.2 實驗儀器

NanoDrop-1000紫外分光光度儀，美國Thermo Scientific公司；真空凍干機，美國Thermo Fisher公司；RM905放射性活度儀，中國計量科學研究院；AXIMA-CFRplus電離飛行質譜儀，英國Kratos Analytical公司；新華一號濾紙，北京化學試劑公司；電泳儀、水平電泳槽，北京六一儀器廠。

2 實驗方法

2.1 siRNA的設計與合成

本研究中siRNA的干擾靶點選擇hTERT mRNA的第14個外顯子的第3119—3137位核苷酸(19 bp)[4]。反義鏈的5’端連接6碳己基及氨基伯胺結構，作為與MAG3偶聯的基團，其3’端的2個脫氧胸腺核苷酸d(TT)結構用于提高反義結合活性。因此反義鏈序列為5’-NH2-(CH2)6-UCCAAACUUGCUGAUGAAAd(TT)-3’。正義鏈序列為5’-UUUCAUCAGCAAGUUUG-GAd(TT) -3’。siRNA雙鏈均由上海GenePharma公司合成，全程2’-甲氧基修飾。合成后進行HPLC純化及RNA變性膠分子量鑒定后以凍干形態保存于-80 ℃。

2.2 siRNA反義鏈與NHS-MAG3偶聯反應

NHS-MAG3偶聯構建99Tcm-siRNA探針的反應路線示于圖1。

取適量凍干反義RNA溶于0.30 mol/L HEPES緩沖液(pH=8.0)中，質量濃度達到10 g/L。在震蕩條件下，將無水DMF新鮮配制的NHS-MAG3溶液加入RNA溶液中，使MAG3/RNA 的最終摩爾比為15∶1，室溫下靜置反應1～2 h[5-6]。反應產物經醋酸銨溶液(0.25 mol/L，pH=7.2)洗脫Sephadex G25層析柱(0.7×28 cm)純化后，按照每管0.5 mL依次收集30管。根據每管洗脫產物在260 nm波長處的吸光度值(A260)，合并RNA峰管后將其真空凍干，保存于-80 ℃備用。

圖1 通過S-乙酰基-NHS-MAG3偶聯的99Tcm標記siRNA反應路線圖Fig.1 Scheme of synthesis of 99Tcm radiolabeled siRNA via chelator of S-Acetyl-NHS-MAG3

2.3 MAG3-siRNA雙鏈形成

取適量偶聯與未偶聯的RNA進行AXIMA-CFRplus 質譜分析，檢測其分子量差以確認偶聯產物的正確性，再將偶聯后的反義鏈和正義鏈退火形成siRNA雙鏈[7]。方法如下：取等量的RNA互補鏈分別溶于退火緩沖液(0.05 mol/L NaCl,10 mmol/L dithiothreitol,10 mmol/L MgCl2,10 mmol/L Tris-Cl,pH=7.5)中，使得質量濃度為1 g/L。將二者混勻后90 ℃加熱1 min，再置于37 ℃水浴1 h退火形成雙鏈。RNA退火產物以每管10 μg分裝、凍干，保存于-80 ℃備用。

2.4 99Tcm標記反應

2.5 標記率和放射化學純度的測定

采用新華一號試紙為固定相、丙酮和生理鹽水為雙展開劑的紙層析法測定標記產物的標記率和放射化學純度。

2.6 標記穩定性分析

將標記產物99Tcm-siRNA分別溶于適量體積的生理鹽水和新鮮人血清中，終濃度為0.01 g/L。分別置于室溫和37 ℃條件下，孵育0.5、1、2、3、4、6 h后，分別取樣紙層析法測定其放化純度。

2.7 活性穩定性分析

HepG2細胞常規37 ℃、5% CO2條件下培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中。待細胞密度達80%左右進行RNA轉染操作，具體參照Lipofectmine 2000說明書。在分別轉染脂質體、未標記的siRNA和99Tcm標記的siRNA后48 h收集細胞，Trizol法提取細胞總RNA。逆轉錄PCR擴增hTERT和GAPDH mRNA，具體擴增引物與條件參照文獻[8]。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

3 結果和討論

3.1 siRNA反義鏈與NHS-MAG3的偶聯反應

偶聯產物經過Sephadex G25層析柱純化后，使用紫外分光光度儀測定其吸光度值，結果示于圖2。發現第7管—第9管和第19管—第21管產物在260 nm處有一定的吸收峰(圖2(a))。但第7管—第9管產物僅在260 nm處測定有吸收峰，且峰值較高，提示該管中含有偶聯產物MAG3-RNA(圖2(b))。而第19管—第21管的吸收峰主要位于230 nm處，而260 nm處的吸收峰僅為230 nm峰的延續，提示主要為未偶聯的游離MAG3離子峰(圖2(c))。

將偶聯后產物MAG3-RNA與偶聯前RNA分別進行質譜分子量分析，結果示于圖3。由圖3可知，偶聯前RNA相對分子質量為7 061.4(圖3(a))，偶聯后MAG3-RNA相對分子質量為7 307.1(圖3(b))，偶聯前后相對分子質量差為245.7。對照MAG3基團的理論相對分子量為245.23，可見螯合前后的相對分子質量差與理論相符，證實了RNA分子與NHS-MAG3成功偶聯。NHS-MAG3作為一種雙功能螯合劑，與RNA的5’或3’末端連接的胺基結合，去除保護巰基的乙酰基，通過轉螯合作用與99Tcm螯合被標記。其優點是標記反應可以在室溫和中性條件下進行[9]，這種溫和的反應條件對防止反應體系中的RNA分子降解起到重要作用，且該螯合劑具有標記率高、穩定性好、脫靶少的優勢[10]，有利于體內研究應用的99Tcm標記的RNA探針的構建。

圖2 偶聯產物經Sephadex G25純化后的紫外分光分析Fig.2 Absorbance analysis of purified products after conjugation (a)——各管在260 nm的吸光度值(Absorbance at 260 nm of all products)，(b)——第8管的吸收峰(Absorbance at 260 nm of tube 8)，(c)——第20管的吸收峰(Absorbance at 260 nm of tube 20)

圖3 偶聯前(a)、后(b)RNA質譜分析Fig.3 MALDITOF-MS analysis of RNAs before (a) and after (b) conjugation

3.2 99Tcm標記結果

表1 使用丙酮和生理鹽水雙展開劑的紙層析檢測結果Table 1 Paper chromatography with acetone and saline at the mobile phase

3.3 影響99Tcm-siRNA標記率的因素

3.3.1反應時間對標記率的影響 不同反應時間對標記率(Y)的影響示于圖4。由圖4可知，在使用1 g/L SnCl2·2H2O條件下，99Tcm-siRNA的標記率在反應1 h內隨著反應時間的增加，標記率顯著提高，由5 min時的38.4%增至1 h時的77.3%；而從1 h到5 h的反應時間內，隨反應時間的延長標記率無顯著提高，維持在78%左右。由此可見經過1 h的反應，RNA分子的99Tcm標記已達到飽和平臺期。考慮到反應時間越長，RNA分子受到理化降解因素的危險就越大，因此本實驗選擇1 h作為最佳標記反應時間，既保證了高標記率，還降低了RNA降解的風險。

圖4 不同反應時間對標記率的影響Fig.4 Effect on the labeling efficiency by different reaction time

3.3.2SnCl2·2H2O用量對標記率的影響 在標記反應中，SnCl2·2H2O主要還原高價99Tcm。siRNA分子通過偶聯的MAG3與99Tcm核素形成螯合物而被標記，但是SnCl2·2H2O過多容易產生過多的锝膠體而降低標記率。本研究分別測定不同質量濃度的SnCl2·2H2O(1、2、4、8、10 g/L)在1 h反應時間中的標記率，以期優化反應條件，結果示于圖5。由圖5可知，反應標記率在SnCl2·2H2O質量濃度為1、2 g/L時均可達較高水平(77.3%和78.0%)，而當SnCl2·2H2O使用量增大時，標記率迅速下降至67.7%，此結果和預期相符，亦和以往針對寡核苷酸的99Tcm標記SnCl2·2H2O使用量[12]一致。

圖5 SnCl2·2H2O的質量濃度對標記率的影響Fig.5 Effect on the labeling efficiency by different mass concentrations of SnCl2·2H2O

3.4 標記產物穩定性分析

圖6顯示99Tcm-siRNA探針在生理鹽水和人新鮮血清2種介質中孵育6 h均能保持良好的穩定性，放化純度(RCP)維持在94%以上。99Tcm-siRNA的放化純穩定性在血清與生理鹽水中、37 ℃和室溫下均無顯著性差異，說明經過2’-OMe化學修飾的RNA探針未受到血清中多種酶成分的影響而無降解發生，且標記探針在不同介質中均保持良好的標記穩定性，無脫標現象。本實驗中37 ℃下血清介質在很大程度上模擬了體內環境，顯示RNA標記探針在模擬體內環境中能保持良好穩定性，為將來體內實驗研究奠定了基礎。以上結果說明，2’-OMe修飾可在標記條件和模擬體內環境下保持RNA分子的穩定性，且通過MAG3螯合的99Tcm標記的產物能保持良好的標記穩定性，采用的化學修飾和標記方法適用于RNA探針。

圖6 99Tcm-siRNA探針的體外穩定性Fig.6 Stability of 99Tcm-siRNA in vitro生理鹽水(Saline)：▲——室溫(RT)，×——37 ℃；人新鮮血清(Serum)：◆——室溫(RT)，■——37 ℃

3.5 活性穩定性分析

經過化學修飾及偶聯標記的siRNA分子是否能夠保持靶向識別能力和干擾活性是評價標記方法是否得當的重要標準。99Tcm-siRNA探針對hTERT靶向mRNA的干擾作用示于圖7。本實驗分別測定未轉染的細胞、僅有脂質體轉染的細胞、脂質體轉染未偶聯標記siRNA的細胞及脂質體轉染偶聯標記siRNA的細胞的hTERT基因mRNA水平。由圖7可知，偶聯標記后的siRNA與未偶聯的siRNA分子具備相似的靶向基因干擾活性((79.2±1.5)%與(81.4±0.5)%))。這一結果證實所采用的MAG3偶聯的99Tcm標記方法對siRNA分子的生物活性影響很小，保證了siRNA分子的靶向識別特異性和干擾活性。這種活性穩定性可能與MAG3基團的分子結構簡單、分子量小因而對RNA分子功能區影響小有關。

圖7 99Tcm-siRNA探針對hTERT靶向mRNA的干擾Fig.7 Inhibition activity on hTERT mRNA of 99Tcm-siRNA1——未轉染細胞(Cells without transfection)，2——脂質體轉染的細胞(Cells transfected with liposome)，3——脂質體轉染未偶聯標記siRNA的細胞(Cells transfected with liposome and unlabeled siRNA)，4——脂質體轉染偶聯標記siRNA后的細胞(Cells transfected with liposome and labeled siRNA)

4 結 論

(1) 通過雙功能螯合劑NHS-MAG3偶聯的siRNA可被放射性同位素99Tcm標記，并獲得較理想的標記率、穩定的放化純和較高的比活度，此標記方法為RNA放射性核素標記研究提供了選擇。

(2) 經過2’-甲氧基修飾的RNA分子在模擬體內環境中保持良好的標記穩定性，為RNA標記探針進一步在體內研究的應用奠定了基礎。

(3) 通過螯合劑NHS-MAG3偶聯的99Tcm標記方法能夠保持RNA分子的生物活性穩定性，確保了標記RNA探針的靶向特異性，利于將來在體內顯像示蹤的應用。

[1] Medarova Z, Pham W, Farrar C, et al.InVivoImaging of siRNA Delivery and Silencing in Tumors[J]. Nat Med, 2007, 13(3): 372-377.

[2] Eckstein F. Phosphorothioate Oligodeoxynucleotides: What is Their Origin and What is Unique About Them?[J]. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2000, 10(2): 117-121.

[3] Grünweller A, Wyszko E, Bieber B, et al. Comparison of Different Antisense Strategies in Mammalian Cells Using Locked Nucleic Acids, 2’-O-Methyl RNA, Phosphorothioates and Small Interfering RNA[J]. Nucleic Acids Res, 2003, 31(12): 3 185-3 193.

[4] Masutomi K, Yu E Y, Khurts S, et al. Telomerase Maintains Telomere Structure in Normal Human Cells[J]. Cell, 2003, 114(2): 241-253.

[5] Wang Y, Liu G, Hnatowich D J. Methods for MAG3Conjugation and99mTc Radiolabeling of Biomolecules[J]. Nat Protoc, 2006, 1(3): 1 477-1 480.

[6] Liu G, Zhang S, He J, et al. Improving the Label-ing of S-Acetyl NHS-MAG3Conjugated Morpholino Oligomers[J]. Bioconjug Chem, 2002, 13(4): 893-897.

[7] Vanitharani R, Chellappan P, Fauquet C M. Short Interfering RNA-Mediated Interference of Gene Expression and Viral DNA Accumulation in Cultured Plant Cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(16): 9 632-9 636.

[8] Nakamura T M, Morin G B, Chapman K B, et al. Telomerase Catalytic Subunit Homologs From Fission Yeast and Human[J]. Science, 1997, 277(5 328): 955-959.

[9] Hnatowich D J, Chang F, Lei K, et al. The Influence of Temperature and Alkaline pH on the Label-ing of Free and Conjugated MAG3With Techne-tium-99m [J]. Appl Radiat Isot, 1997, 48(5): 587-594.

[10] 劉 萌,王榮福.S-乙酰基-NHS-MAG3在反義顯像研究中的應用及進展[J].同位素,2004,17(3):164-168.

[11] Liu N, Ding H, Vanderheyden J L, et al. Radiolabeling Small RNA With Technetium-99m for Visualizing Cellular Delivery and Mouse Biodistribution[J]. Nucl Med Biol, 2007, 34(4): 399-404.

[12] Liu M, Wang R F, Zhang C L, et al. Noninvasive Imaging of Human Telomerase Reverse Transcriptase (hTERT) Messenger RNA With99mTc-Radiolabeled Antisense Probes in Malignant Tumors[J]. J Nucl Med, 2007, 48(12): 2 028-2 036.