99Tcm標(biāo)記的PEG4/2PEG4修飾的環(huán)狀RGD二聚體體內(nèi)外性質(zhì)的對(duì)比

靳存敬，史繼云，劉 妍，靳曉娜，黃金銘，趙慧云，李 方，王 凡，*

1.北京大學(xué) 醫(yī)學(xué)同位素研究中心，北京 100191；2.北京協(xié)和醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100730

實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是新生血管生成(angiogenesis)[1]。在諸多針對(duì)血管為靶點(diǎn)的腫瘤治療中，整合素(integrin)αvβ3受到廣泛的關(guān)注，它在腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面和多種惡性腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，而在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和絕大多數(shù)正常組織器官不表達(dá)或表達(dá)很低，并且在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、遷移、生長(zhǎng)、分化過程中發(fā)揮重要作用[2-4]。整合素αvβ3能識(shí)別配體分子中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列，因此為設(shè)計(jì)含有RGD序列的多肽藥物用于整合素αvβ3陽性腫瘤的檢測(cè)和治療提供了理論基礎(chǔ)[5-6]。

放射性核素標(biāo)記的RGD多肽已廣泛用于腫瘤的顯像和治療研究[7-8]。為了增加RGD多肽與整合素αvβ3的親和力，人們將“多聚化”的概念引入到RGD多肽放射性藥物的研究中[9-10]。另外，為了改善放射性藥物的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，人們對(duì)標(biāo)記藥物進(jìn)行修飾，包括糖基化、引入水溶性的氨基酸和聚乙二醇(PEG)[7]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中也對(duì)有關(guān)RGD多肽多聚化以及結(jié)構(gòu)修飾方面的工作進(jìn)行了報(bào)道[11-16]。

本研究以HYNIC為雙功能螯合劑，用99Tcm標(biāo)記PEG4修飾的2種RGD二聚體衍生物：在2個(gè)RGD模序(motif)間引入2個(gè)PEG4分子；在RGD二聚體與HYNIC雙功能螯合劑間引入1個(gè)PEG4分子(圖1)，比較在不同部位引入PEG4分子對(duì)受體配體親和力的影響，以及對(duì)標(biāo)記藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響，并對(duì)其在正常鼠體內(nèi)的生物分布進(jìn)行評(píng)價(jià)。

圖1 RGD環(huán)肽二聚體及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of cyclic RGD dimer and its derivatives

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑

Na99TcmO4，北京原子高科核技術(shù)股份有限公司；HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer，結(jié)構(gòu)示于圖1，美國Purdue大學(xué)劉爽教授饋贈(zèng)；三羥甲基甘氨酸(Tricine，N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine)、三苯基膦三間磺酸鈉(TPPTS，trisodium triphenylphosphine-3,3′,3″-trisulfonate)，美國SIGMA公司；丙酮、乙腈、醋酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃鹽酸等，分析純，北京試劑公司；快速薄層層析-硅膠紙(ITLC-SG)，美國Gelman公司。96孔細(xì)胞抽濾板，美國Millipore公司。

1.2 儀器

CRC-15R放射性活度計(jì)，美國Capintec公司；1470-002全自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀，美國Perkin Elmer公司；AR-2000 放射性薄層掃描儀，美國Bioscan公司；HP1100高效液相色譜(帶有Berthold公司的LB-509放射性檢測(cè)器)，美國安捷倫公司；Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小白鼠，雌性，約25 g，二級(jí)，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 3種標(biāo)記化合物的制備

在Eppendorf(EP)管中加入6.50 mg Tricine、5.00 mg TPPTS、20 μL HYNIC偶聯(lián)的不同的RGD多肽(HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer)(1 g/L)、100 μL琥珀酸緩沖溶液(pH=5.0，25 mmol/L)，最后加入100 μL Na99TcmO4(約74 MBq)，混勻，100 ℃反應(yīng)20 min，取樣進(jìn)行ITLC和HPLC分析。注射前用Sep-Pak C18小柱對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行純化，并過0.22 μm濾膜。

2.2 質(zhì)量控制方法

2.2.1薄層層析法(ITLC) 將標(biāo)記物點(diǎn)樣于ITLC濾紙上，于丙酮展開體系中上行展開，用放射性薄層掃描儀進(jìn)行掃描，計(jì)算標(biāo)記率和放化純度。

2.2.2HPLC法 使用LabAlliance HPLC系統(tǒng)，配備放射性在線檢測(cè)器和Zorbax C18分析柱(4.6 mm×250 mm,30 nm pore size)，梯度淋洗30 min，流速1.0 mL/min，其中流動(dòng)相A為醋酸氨緩沖液(NH4OAc，0.025 mol/L，pH=5.0)，B為乙腈，流速為1.0 mL/min，淋洗梯度設(shè)定為起始至2 min時(shí)90% A和10% B，5 min時(shí)85% A和15% B，15 min時(shí)80% A和20% B，20—25 min時(shí)50% A和50% B，26—30 min回到基線梯度90% A和10% B。

2.3 脂水分配系數(shù)的測(cè)定

將100 μL標(biāo)記物加入到含有400 μL磷酸緩沖溶液(PB，pH=7.4，0.05 mol/L)和500 μL正辛醇的EP管中，蝸旋4 h后在8 000 r/min 條件下離心10 min，取等體積有機(jī)相和水相測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算標(biāo)記物的脂水分配系數(shù)P(有機(jī)相計(jì)數(shù)/水相計(jì)數(shù))及l(fā)gP。

2.4 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)

采用Iodogen方法制備125I-c(RGDyK)，比活度約為3.7×1013Bq/mmol。U87MG人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM(低糖)培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。參考Chen[17]的方法，制細(xì)胞懸液，并按每孔105個(gè)細(xì)胞鋪于Multiscreen 96孔抽慮板上，加入約2×105/min的125I-c(RGDyK)以及濃度依次遞升的3種RGD多肽(0～1 000 nmol/L)，用結(jié)合緩沖液(pH=7.4，500 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L MnCl2和w=1%的牛血清白蛋白)將反應(yīng)體積調(diào)節(jié)到200 μL，4 ℃孵育2 h，洗去未結(jié)合的125I-c(RGDyK)，收集濾膜并在γ計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行測(cè)量，用GraphPad Prism 4.0(GraphPad軟件,SanDiego,CA)軟件進(jìn)行擬合，非線性回歸分析計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.5.1標(biāo)記物的藥代動(dòng)力學(xué) 選取21只ICR小白鼠，隨機(jī)分成3組，每組7只。經(jīng)尾靜脈注射100 μL(約370 kBq)3種不同標(biāo)記物，于注射后1、3、5、7、10、15、20、30、60、120 min取尾靜脈血，稱重并測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，經(jīng)衰變校正后計(jì)算每毫升血液的百分注射劑量率Dinj(%ID/mL)，繪制血液清除曲線。

2.5.2標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的生物分布 將36只ICR小白鼠隨機(jī)分成3組，每組12只，分別經(jīng)尾靜脈注射100 μL(約370 kBq)3種不同標(biāo)記物，于注射后0.5、1、4 h按組(每組4只)將實(shí)驗(yàn)小鼠處死，取血及主要臟器，稱重并測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，經(jīng)衰變校正后計(jì)算每克組織的百分注射劑量率(%ID/g)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Prism 4.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果和討論

3.1 標(biāo)記物的制備及質(zhì)控

在ITLC分析方法中，標(biāo)記化合物的Rf=0.0～0.1，游離99Tcm的Rf=0.9～1.0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種標(biāo)記化合物的標(biāo)記率均達(dá)到98%以上。本研究采用TPPTS作為協(xié)同配體，它同時(shí)具有還原作用，因此在標(biāo)記過程中不用加入氯化亞錫，這樣可以防止锝膠體的生成。

純化后3種標(biāo)記物的HPLC分析結(jié)果示于圖2。由圖2可以看出,99Tcm-HYNIC-RGD dimer的保留時(shí)間為10.64 min，99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer的保留時(shí)間為10.53 min,99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的保留時(shí)間為11.53 min(游離99Tcm的保留時(shí)間約為3 min)，3種標(biāo)記物的放射化學(xué)純度均大于99%。

圖2 3種99Tcm標(biāo)記物的放射性HPLC圖譜Fig.2 Radio-HPLC chromatogram of three 99Tcm-labeled compounds

3.2 脂水分配系數(shù)

化合物的脂水分配系數(shù)可以用于評(píng)價(jià)標(biāo)記物的水溶性，脂水分配系數(shù)越大說明標(biāo)記物的脂溶性越好。99Tcm-HYNIC-RGD dimer，99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer和99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的lgP分別為-2.24±0.01(n=3)，-2.78±0.04(n=3),-2.52±0.02(n=3)。結(jié)果表明，PEG4的引入使2種衍生物的水溶性有所增加。

3.3 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究

通過c(RGDyK)、HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer競(jìng)爭(zhēng)125I-c(RGDyK)與U87MG細(xì)胞表面整合素αvβ3的結(jié)合，比較了4種配體對(duì)整合素αvβ3的親和力(圖3)，它們的IC50值分別為37.29±5.00、8.43±0.62、7.53±0.51、2.90±0.31 nmol/L。IC50值越小，表明親和力越強(qiáng)。HYNIC-2PEG4-RGD dimer與整合素αvβ3的親和力約為HYNIC-RGD dimer的2.5倍，約為RGD單體的12倍。HYNIC-PEG4-RGD dimer與HYNIC-RGD dimer相比，親和力無顯著差異。HYNIC-2PEG4-RGD dimer是在2個(gè)RGD模序(motif)之間引入2個(gè)PEG4分子，從而2個(gè)RGD模序之間的距離從6個(gè)化學(xué)鍵長(zhǎng)增加到38個(gè)化學(xué)鍵長(zhǎng)，這樣2個(gè)RGD分子可以同時(shí)與細(xì)胞表面2個(gè)相鄰的整合素αvβ3受體相結(jié)合，增強(qiáng)了結(jié)合的親和力。這與Wang等[18]的研究結(jié)果相一致。HYNIC-PEG4-RGD dimer是在RGD多肽與雙功能螯合劑HYNIC之間引入1個(gè)PEG4分子，沒有改變2個(gè)RGD模序之間的距離，因此其與整合素αvβ3的親和力沒有明顯改變。

圖3 受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Receptor competitive binding assay■——c(RGDyK)，▼——HYNIC-RGD dimer,◆——HYNIC-PEG4-RGD dimer,●——HYNIC-2PEG4-RGD dimer

3.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

3.4.1藥代動(dòng)力學(xué)研究 3種標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的血液清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖4。從圖4可以看出，3者均符合二室代謝模型，其中99Tcm-HYNIC-RGD dimer的分布相為0.76 min，消除相為17.10 min；99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer的分布相為0.72 min，消除相為24.23 min；99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的分布相為0.62 min，消除相為14.39 min。3種標(biāo)記物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)相似，并都符合多肽類藥物分布清除快的特點(diǎn)。

圖4 3種99Tcm標(biāo)記物的血液清除曲線Fig.4 Blood clearance of three 99Tcm-labeled compounds▲——HYNIC-PEG4-RGD dimer,■——HYNIC-RGD dimer,●——HYNIC-2PEG4-RGD dimer

3.4.2藥物在正常鼠體內(nèi)的生物分布 3種標(biāo)記物在正常小鼠體內(nèi)的生物分布數(shù)據(jù)列于表1。從表1可以看到，注射后0.5 h99Tcm-HYNIC-

PEG4-RGD dimer((17.61±1.87)%ID/g)在腎的攝取高于99Tcm-HYNIC-RGD dimer((13.85±1.91)%ID/g,P<0.05)，其余臟器各標(biāo)記物組別間沒有差異，這表明PEG4作為藥代動(dòng)力學(xué)修飾分子增強(qiáng)了標(biāo)記物的親水性，從而增強(qiáng)了其從腎臟的排泄；注射后4 h腸對(duì)99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer((4.01±0.90)%ID/g)的攝取高于99Tcm-HYNIC-RGD dimer((2.12±0.71)%ID/g，P<0.05)，我們考慮這是否是由于腸中有整合素αvβ3的表達(dá)，2個(gè)PEG4的引入明顯提高了配體受體的親和力，從而增加了腸的攝取，這需要通過Western Blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證；腎對(duì)99Tcm-HYNIC-RGD dimer的攝取低于其余2種標(biāo)記物，這與脂水分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果相一致，PEG4的引入使2種衍生物的水溶性有所增加。

表1 3種99Tcm標(biāo)記物的正常鼠生物分布Table 1 Biodistribution of three 99Tcm-labeled compounds in normal mice

注(Note)：n=4

4 結(jié) 論

在本研究中，3種99Tcm標(biāo)記的RGD二聚體在所用標(biāo)記條件下均獲得大于98%的標(biāo)記率；競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HYNIC-2PEG4-RGD dimer與整合素αvβ3的親和力明顯高于其它2種化合物；藥代動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了3種多肽類藥物的代謝特點(diǎn)，均有較快的分布相和消除相；正常鼠體內(nèi)生物分布結(jié)果表明，PEG4的引入增強(qiáng)了標(biāo)記物的水溶性。99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer具有更好的體內(nèi)外性質(zhì)，作為一種潛在的腫瘤顯像劑，具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值。

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