1例L型支氣管戈登菌肺部感染的報(bào)道

陳玉芊，同重湘，姜元，水永珍，田麗麗，張穎,3，祝秉東

1. 蘭州大學(xué)結(jié)核病研究中心暨病原生物學(xué)研究所，蘭州730000； 2. 蘭州市肺科醫(yī)院，蘭州730000； 3. 美國約翰霍普金斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院分子微生物免疫學(xué)系

為了研究結(jié)核分枝桿菌(簡稱結(jié)核桿菌)等細(xì)菌的L型，我們篩查了2008年9月～2009年9月于蘭州市肺科醫(yī)院就診的340例患者痰培養(yǎng)標(biāo)本，在1例臨床疑診為肺結(jié)核病的患者痰標(biāo)本中篩選到放線菌目戈登菌屬支氣管戈登菌(Gordoniabronchialis，G.bronchialis)的L型。L型細(xì)菌在1935年由英國學(xué)者Klieneberger在研究鼠咬熱的病原體念珠狀鏈桿菌時(shí)報(bào)道。由于其細(xì)胞壁部分或完全缺失(cell wall deficient form，CWD-form)，菌體呈高度多型性，Klieneberger用其研究所Lister的首字母命名為L型細(xì)菌[1]。根據(jù)細(xì)胞壁的缺失程度將其分為原生質(zhì)體(完全缺失)和原生質(zhì)球(部分缺失)[2]，均可在合適的滲透壓培養(yǎng)基中生長繁殖[3]。根據(jù)L型細(xì)菌自發(fā)回復(fù)為細(xì)胞壁完整細(xì)菌的能力，將其分為穩(wěn)定型和不穩(wěn)定型[2]。細(xì)胞壁的缺失使L型細(xì)菌的形態(tài)多樣，且革蘭染色和抗酸染色為陰性[4]。目前認(rèn)為L型細(xì)菌是病原菌與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的結(jié)果[5]，可能與動(dòng)物和人慢性感染性疾病的發(fā)病過程有關(guān)[2,6,7]，但機(jī)制尚不清楚。

1 臨床材料

1.1 病例

患者，男性，78歲，農(nóng)民。間斷性咳嗽、咳痰4年，加重1個(gè)月，于2008年10月13日入住甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院。痰標(biāo)本培養(yǎng)菌株編號為866。患者自述4年前開始每遇天氣轉(zhuǎn)涼即出現(xiàn)咳嗽，咳白色黏液性痰，并伴氣短。多次就診，診斷為“慢性支氣管炎、肺心病”。給予抗炎利痰對癥治療后，癥狀緩解。否認(rèn)服用抗結(jié)核藥。入院前1個(gè)月上述癥狀逐漸加重，對癥治療，療效欠佳。

入院時(shí)查體：腋下體溫36 ℃， 心率80次/min，血壓 155/95 mmHg。神志清，精神欠佳，體形正常，扶入病房。咽部無充血，扁桃體無腫大，雙側(cè)呼吸動(dòng)度減弱，叩診過清音，雙肺呼吸音粗，肺底可聞及細(xì)濕啰音。腹平軟，無壓痛、反跳痛，肝、脾不大。血常規(guī)檢查：白細(xì)胞2.9×109/L，淋巴細(xì)胞絕對值0.8×109/L，紅細(xì)胞6.55×1012/L,血紅蛋白含量208 g/L，平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量31.7 pg。生化檢查：谷丙轉(zhuǎn)氨酶57 u/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶41 u/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶0.7，載脂蛋白A 0.94 g/L，載脂蛋白B 1.18 g/L，乳酸脫氫酶260 u/L，腺苷脫氨酶31 u/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白6.08 g/L，β2-微球蛋白3.3 mg/L。胸腔積液生化顯示：總蛋白 52 g/L，腺苷脫氨酶64 g/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白1.26 g/L。胸腔積液涂片見大量散在的淋巴細(xì)胞。胸水中甲胎蛋白0.83 ng/ml，癌胚抗原0.58 ng/ml，腫瘤相關(guān)因子18.78 u/ml。入院后常規(guī)痰檢示痰涂片抗酸桿菌陰性。胸部計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)顯示：雙肺間質(zhì)紋理增粗，肺內(nèi)散布片絮狀高密度灶，伴雙側(cè)胸腔積液，縱隔可見鈣化的淋巴結(jié)，左心室增大。

入院診斷為肺心病。肺部有炎癥，給予左氧氟沙星0.4 g/d，靜脈點(diǎn)滴1周；頭孢他啶 2 g/d，靜脈點(diǎn)滴1 d；診斷性抗結(jié)核治療(對氨基水楊酸異煙肼片 0.3 g，每天1次；利福平0.45 g，每天1次；乙胺丁醇0.75 g，每天1次)和對癥支持治療，15 d后癥狀好轉(zhuǎn)出院。

1.2 材料和方法

1.2.1主要試劑Middlebrook 7H9(8X07131)、BACTEC MGIT-960液體培養(yǎng)基購于美國BD公司，小牛血清組分v(A8020)和過氧化氫酶(C8070)購于瑞士羅氏制藥公司，基因組提取試劑盒(N9021)購于東盛生物有限公司，DNA STAR 聚合酶和膠回收試劑盒購于TaKaRa，TaqDNA聚合酶為美國Fermentas公司產(chǎn)品，雞蛋為正大鮮雞蛋。

1.2.2痰標(biāo)本的細(xì)菌培養(yǎng)取患者晨起漱口后深部咳出的痰做標(biāo)本，經(jīng)消化、離心、棄上清液后加入適量磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)，重懸、沉淀，取300 μl分別接種于BACTEC MGIT-960液體、含蔗糖的Middlebrook 7H9(7H9-L)半固體、不含蔗糖的Middlebrook 7H9(7H9-B)半固體、含氯化鈉的92-3 TB(92-3 TB-L)液體、不含氯化鈉的92-3 TB(92-3 TB-B)液體[8]及羅氏(Lownstein-Jenson，L-J)培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)。

1.2.3顯微鏡鏡檢取患者晨起漱口后深部咳出的痰做檢查。①抗酸染色：將痰涂片，加熱固定，堿性石炭酸復(fù)紅初染，3%鹽酸酒精脫色，亞甲藍(lán)復(fù)染，干燥后光學(xué)顯微鏡下鏡檢[9]。②革蘭染色：將痰涂片，自然干燥，結(jié)晶紫初染，碘液媒染，95%乙醇脫色，稀釋復(fù)紅復(fù)染，干燥后光學(xué)顯微鏡下鏡檢[9]。

1.2.4細(xì)菌回復(fù)實(shí)驗(yàn)將該菌株培養(yǎng)至呈煎蛋樣生長的L型細(xì)菌，接種于羅氏培養(yǎng)基或7H9-B半固體培養(yǎng)基，觀察細(xì)菌生長狀況及形態(tài)改變。

1.2.5掃描電子顯微鏡觀察刮取培養(yǎng)的菌落，置于1.5 ml的Eppendorf管中，加入3%磷酸戊二醛固定過夜。在蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心電子顯微鏡室處理并用掃描電子顯微鏡觀察。

A: Colonies grew on 7H9-L semi-solid medium. B: With the growth of No. 866 strain, the 92-3 TB-L liquid medium (left) became more turbid than the blank (right). C: The fried egg-like colonies (amplified from Fig. A). D: The bacteria before subculture were spherical and negative to the acid-fast staining.圖1 不同培養(yǎng)基中編號866菌株培養(yǎng)結(jié)果 Fig.1 The culture results of No. 866 strain in different media

1.2.616SrRNADNA的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)擴(kuò)增用DNA提取試劑盒提取該菌株DNA，擴(kuò)增長度為580 bp的16S rRNA DNA序列。16S rRNA DNA上游引物：5′-CAC ATG CAA GTC GAA CGG AAA GG-3′；下游引物：5′-GCC CGT ATC GCC CGC ACG CT-3′。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(NSBC-Sangon，上海)合成。PCR反應(yīng)體系：DNA混合液(各2.5 mmol/L) 4 μl，PCR緩沖液(5×) 10 μl，PrimeSTAR DNA多聚酶(2.5 u/μl) 0.5 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl，模板DNA 2 μl (20 ng/m1)，最后補(bǔ)充雙蒸去離子水至50 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。

1.2.7PCR產(chǎn)物純化及DNA序列分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml溴化乙啶)上電泳，按照操作手冊用DNA膠回收試劑盒回收目的片段后測序。測序結(jié)果用GenBank BLAST軟件進(jìn)行同源性分析。

1.2.8藥敏試驗(yàn)應(yīng)用羅氏培養(yǎng)基按絕對濃度法進(jìn)行抗結(jié)核藥敏試驗(yàn)。制備1 mg/ml菌懸液，10倍稀釋法稀釋至0.01 mg/ml，取0.1 ml分別接種于含藥培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基斜面上，每管接種菌量為0.001 mg，37 ℃培養(yǎng)4周。對照培養(yǎng)基生長旺盛而低濃度含藥培養(yǎng)基菌落生長者報(bào)告為耐藥(R)。其他抗生素的測定采用K-B紙片法(包括阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、呋喃唑酮5個(gè)藥物)：0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙河脽o菌棉拭均勻涂布于羅氏培養(yǎng)基，貼藥敏紙片后置37 ℃孵箱培養(yǎng)，精確量取抑菌環(huán)直徑。直徑>20 mm為極敏，15～20 mm為高敏，10～14 mm為中敏，<10 mm為低敏，0 mm為不敏。

2 結(jié)果

痰標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)，在92-3 TB-L液體培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，表明有細(xì)菌生長。在7H9-L半固體含蔗糖培養(yǎng)基中有煎蛋樣的菌落出現(xiàn)(圖1A～C)。抗酸染色可見抗酸染色陰性、大小不等、球狀或短桿狀的細(xì)菌(圖1D)。將上述菌落在羅氏培養(yǎng)基和7H9-B半固體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，均有橘紅色的菌落生長(圖2A、B)。少量細(xì)菌回復(fù)為抗酸染色弱陽性桿狀菌，但仍有抗酸染色陰性、大小不等的球狀菌(圖2C)。革蘭染色可見紫紅色桿狀菌(圖2D)。掃描電子顯微鏡下可見傳代培養(yǎng)后菌落呈團(tuán)塊狀生長，菌體呈桿狀(圖2E、F)。PCR擴(kuò)增16S rRNA DNA的測序結(jié)果與支氣管戈登菌DSM 43247相似性為100%(圖3)，可見從該患者痰液中分離、培養(yǎng)出L型支氣管戈登菌。藥敏試驗(yàn)顯示，該菌對利福平、利福噴汀、阿莫西林、左氧氟沙星和克拉霉素敏感，對異煙肼、鏈霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、對氨基水楊酸、丙硫異煙胺、甲硝唑和呋喃唑酮耐藥(圖4)。

After subculture of the No. 866 strain, some pinkish and reddish colonies grew well in L-J medium (A) and 7H9-B semi-solid medium (B). After acid-fast staining, there were some positive rod-like bacteria (C). The bacteria subcultured were violet after Gram-staining (D). The subcultured bacteria were rod-shaped under scanning electron microscope (E, F).

圖2編號866菌株的傳代培養(yǎng)

Fig.2ThesubcultureofNo.866strain

Comparing the gene sequence of 16S rRNA DNA of No. 866 strain with the gene pool of National Center for Biotechnology Information (NCBI) by Blast soft, it was 100% similar with that ofG.branchialis. It indicates that the No. 866 strain belongs toG.branchialis.

圖3編號866菌株16SrRNADNA基因序列比對分析

Fig.3Thegenesequenceanalysisof16SrRNADNAofNo.866strain

The No. 866 strain was sensitive to rifampin (RFP), rifapentine (RFD), amoxicillin, levofloxacin, and clarithromycin, but resistant to isoniazid (INH), streptomycin (SM), pyrazinamide (PZA), aminosalicylate (PS), ethambutol (EMB), protionamide (TH), metronidazole, and furazolidone. 圖4 編號866菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果 Fig.4 The drug susceptibility test of No. 866 strain

3 討論

3.1 支氣管戈登菌的研究進(jìn)展

1883年，Malassez等報(bào)道結(jié)核桿菌的L型可感染動(dòng)物，并在感染動(dòng)物組織中可見結(jié)核桿菌桿狀的完整細(xì)菌型[2]。1971年Tsukamura在日本發(fā)現(xiàn)放線菌目中的新菌屬戈登菌屬，易被誤診為結(jié)核桿菌，但兩者生物學(xué)特性并不相同。如戈登菌屬抗酸性較結(jié)核桿菌弱，呈短桿狀，沒有菌絲體形成，28～37 ℃培養(yǎng)可見橘黃色粗糙菌落，對小鼠、兔、豚鼠及雞沒有致病性等，其中支氣管戈登菌最為典型[10]。本文中866菌株傳代培養(yǎng)后呈橘黃色菌落，與既往報(bào)道相符。最近幾年，不斷有關(guān)于戈登菌屬新型菌株的報(bào)道，先后發(fā)現(xiàn)了G.westfalica[11]、G.namibiensis[12]、G.soli[13]、G.sinesedis[14]、G.sihwensis[15]、G.defluvii[16]、G.desulfuricans[17]、G.cholesterolivorans[18]和G.shandongensis[19]。

戈登菌可感染免疫力缺陷[20-22]和免疫力正常的患者[23]，如支氣管戈登菌致糖尿病患者肺部感染[24]，引起免疫力正常患者乳腺膿腫[25]。日本Aoyanma等從1999～2008年的臨床樣本中篩查到31例戈登菌屬菌株，其中14株為Gordoniasputi，13株為支氣管戈登菌。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它們對氨芐西林(1株例外)、亞胺培南(1株例外)、磺胺類、米諾卡星(1株例外)，以及新一代的喹諾酮類如左氧氟沙星和環(huán)丙沙星敏感；對苯唑西林、哌拉西林及頭孢類抗生素的敏感性有種的差異；同一菌種菌株間又呈多樣性[26]。

3.2 L型細(xì)菌的形成機(jī)制

L型細(xì)菌的形成機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為其形成與細(xì)菌生存環(huán)境改變和人工誘導(dǎo)作用有關(guān)，也可能與治療過程有關(guān)。①抗生素使用不規(guī)范：作用于細(xì)胞壁類的藥物有效濃度不夠、療程不足，造成細(xì)菌未被徹底殺死，部分細(xì)菌細(xì)胞壁無法合成，但菌體仍能生存，成為L型細(xì)菌。②宿主機(jī)體的代謝原因：酸中毒及厭氧條件(深部感染)下，細(xì)菌因生存環(huán)境改變而導(dǎo)致L型細(xì)菌形成。③宿主機(jī)體抗感染免疫系統(tǒng)及免疫物質(zhì)的作用：宿主的不完全吞噬作用及機(jī)體體液中各種抗感染免疫物質(zhì)如溶菌酶、乙型溶素等對細(xì)菌的不完全作用，可誘導(dǎo)L型細(xì)菌產(chǎn)生[27,28]。體外使用抗生素可誘導(dǎo)L型細(xì)菌形成[29-31]。

3.3 本例分析

本例患者間斷性咳嗽、咳痰4年余，多次用抗生素治療無效；血生化檢查，白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞絕對值較正常偏低，提示免疫力低下，構(gòu)成了L 型細(xì)菌形成的條件。菌株培養(yǎng)、電子顯微鏡及PCR均證實(shí)該菌株為L型支氣管戈登菌。我們尚不能確定該菌就是引起本例患者肺部感染的致病菌，但結(jié)合細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果和患者病史，仍推測支氣管戈登菌是導(dǎo)致本例患者肺部感染的病原菌之一。

雖然目前也有一些支氣管戈登菌致病的報(bào)道[10, 24-26,32]，但還沒有其L型致病的報(bào)道。L型細(xì)菌與細(xì)菌潛伏、持續(xù)性感染及疾病的復(fù)發(fā)有關(guān)，是引起難治性肺部感染疾病的原因之一[33,34]。我們在1例肺部感染的老年患者痰液中檢出L型支氣管戈登菌，提示對反復(fù)發(fā)作的肺部感染要考慮L型支氣管戈登菌感染的可能。

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