中國部分地區豬細環病毒1型和2型的分子檢測

翟少倫，龍進學，岳城，袁世山

1. 中國農業科學院上海獸醫研究所豬傳染病防治研究室，上海 200241； 2. 新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052

細環病毒(Torque teno virus，TTV)[1]于1997年由日本科學家Nishizawa等[2]在1例輸血后肝炎患者的血清中發現，并將該病毒以患者的名字命名為Torque teno virus。其基因組為單股環狀DNA，此前被劃為圓環病毒科[3]，隨后被劃為獨立的指環病毒屬[4]。豬細環病毒(porcine Torque teno virus，PTTV)分2個基因型(PTTV1和PTTV2)。研究認為，患仔豬斷奶多系統衰竭綜合征的豬群易感染PTTV2[5]。PTTV1與豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)共感染可導致仔豬斷奶多系統衰竭綜合征、豬腎病與皮炎綜合征的發生[6,7]。

目前，PTTV1和PTTV2的流行已在世界多個國家報道，我國報道還較少。本研究通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測2009年收集的我國部分發病豬場及健康豬場的232份樣品，調查PTTV1及PTTV2的流行情況，為PTTV感染的防控提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

樣品包括2009年送檢的來自我國9個省市發病豬場的104份組織、80份血清和7份精液，以及41份健康豬血清。病毒DNA提取試劑盒為天根公司產品，PCR常用相關試劑為東盛公司產品。

1.2 病毒核酸的提取

取200～300 mg組織樣品勻漿處理，用1 ml 磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)稀釋溶解，分別取200 μl組織和血清，按DNA提取試劑盒說明書操作。提取后的DNA溶于50 μl Tris-EDTA緩沖液中，凍存于-30 ℃備用。

1.3 PCR 擴增

檢測PTTV1所用引物(PTTV1-F：5′-CGGGTTCAGGAGGCTCAAT -3′；PTTV1-R：5′-GCCATTCGGAACTGCACTTACT-3′)以及檢測PTTV2所用引物(PTTV2-F：5′-TCATGACAGG GTTCACCGGAA-3′；PTTV2-R：5′-CGTCTGC GCACTTACTTATATACTCTA-3′)參考已發表文獻[8]，由上海Invitrogen公司合成。 PTTV1和PTTV2的PCR目的產物大小分別為305 bp和253 bp。PCR體系及反應程序略有改動。檢測PTTV1的PCR反應體系(25 μl)：PTTV1-F(10 μmol/L)0.5 μl，PTTV1-R(10 μmol/L)0.5 μl，2×Mix 12.5 μl，ddH2O 8.5 μl，DNA 3 μl。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，50個循環；72 ℃再延伸5 min。檢測PTTV2的PCR反應體系及反應條件同PTTV1。

1.4 統計學分析

為評估發病豬場及健康豬場中PTTV流行情況是否存在顯著性差異，進行卡方檢驗，P<0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 PTTV在發病豬樣品中的檢測結果

提取191份病料的DNA，分別用PTTV1和PTTV2特異性引物進行PCR檢測，產物進行凝膠電泳分析。結果147份病料出現目的條帶，部分樣品檢測的電泳結果見圖1。

檢測結果顯示，PTTV在我國送檢病料的不同地域均有流行。9個省市送檢病料中，PTTV的總陽性率為61.0%～100%(表1)。其中，新疆、安徽、北京、江蘇和河北送檢病料中PTTV總陽性率高達100%。進一步分析發現，病料中PTTV1與PTTV2的共感染率也較高。PTTV在病豬性別或年齡方面的流行病學分析顯示，種公豬和種母豬存在較高的流行(69.2%～100%)，同時死胎中也檢測到PTTV1和PTTV2的存在。另外，在送檢的7份精液中僅3份檢出PTTV1，沒有檢測到 PTTV2(樣品數量有限)。結果提示，PTTV可通過性接觸、人工授精等垂直傳播，這可能是仔豬PTTV感染率高(80.3%)的原因之一(表2)。對不同類型樣品中PTTV的陽性率分析顯示，組織樣品中感染率略高于血清樣品(表3)。

根據樣品的送檢日期，按季度分析PTTV的檢出率(圖2)。結果顯示，PTTV在2009年第3、4季度呈高流行，但無顯著差異。

圖1PCR檢測發病豬樣品中PTTV的部分電泳結果

Fig.1ElectrophoresisidentificationresultsofpartialsamplesfromdiseasedpigsforPTTVdetectionbyPCR

表19個不同省市發病豬場中PTTV的檢測結果

Tab.1DetectionresultsofPTTVindifferentpigfarmsfrom9regions

SourcePTTVPTTV1PTTV2PTTV1/2Jiangxi(n=28)67.9%(19/28)67.9%(19/28)32.1%(9/28)32.1%(9/28)Zhejiang(n=59)61.0%(36/59)45.8%(27/59)42.4%(25/59)27.1%(16/59)Xinjiang(n=5)100%(5/5)80.0%(4/5)100%(5/5)80.0%(4/5)Anhui(n=21)100%(21/21)95.2%(20/21)71.4%(15/21)66.7%(14/21)Henan(n=24)66.7%(16/24)62.5%(15/24)25.0%(6/24)20.8%(5/24)Beijing(n=9)100%(9/9)100%(9/9)88.9%(8/9)88.9%(8/9)Jiangsu(n=22)100%(22/22)95.5%(21/22)90.9%(20/22)86.4%(19/22)Shanghai(n=18)77.8%(14/18)72.2%(13/18)61.1%(11/18)55.6%(10/18)Hebei(n=5)100%(5/5)60.0%(3/5)80.0%(4/5)40.0%(2/5)Total(n=191)77.0%(147/191)68.6%(131/191)53.9%(103/191)45.5%(87/191)

表2不同性別或年齡病豬中PTTV的檢測結果

Tab.2DetectionresultsofPTTVindiseasedpigswithdifferentgendersorages

Types of pigsPTTVPTTV1PTTV2PTTV1/2Adult sow(n=26)69.2%(18/26)65.4%(17/26)53.8%(14/26)50.0%(13/26)Adult boar(n=9)100%(9/9)88.9%(8/9)88.9%(8/9)77.8%(7/9)Stillborn(n=14)42.9%(6/14)35.7%(5/14)7.1%(1/14)0%(0/14)Piglet(n=142)80.3%(114/142)71.1%(101/142)56.3%(80/142)47.2%(67/142)Total(n=191)77.0%(147/191)68.6%(131/191)53.9%(103/191)45.5%(87/191)

表3病豬不同類型樣品中PTTV的檢測結果

Tab.3DetectionresultsofPTTVindifferentsampletypesfromdiseasedpigs

Types of samplesPTTVPTTV1PTTV2PTTV1/2Tissue(n=104)80.8%(84/104)70.2%(73/104)60.6%(63/104)50.0%(52/104)Serum(n=80)75.0%(60/80)68.8%(55/80)50.0%(40/80)43.8%(35/80)Semen(n=7)42.9%(3/7)42.9% (3/7)0%(0/7)0%(0/7)Total(n=191)77.0%(147/191)68.6%(131/191)53.9%(103/191)45.5%(87/191)

圖22009年不同季度PTTV的流行情況

Fig.2PrevalenceofPTTVindifferentquartersin2009

2.2 PTTV在健康豬血清中的檢測結果

采取同樣的PCR方法，檢測41份健康豬血清中PTTV的感染情況。結果顯示，PTTV總陽性率、PTTV1單一陽性率、PTTV2單一陽性率及兩基因型的共感染率分別為43.9% (18/41)、36.6%(15/41)、24.4%(10/41)和12.2%(5/41)。卡方檢驗結果顯示，健康豬體內PTTV陽性率、PTTV1單一陽性率、PTTV2單一陽性率及兩基因型共感染率均比發病豬低(P<0.01)。提示PTTV在發病豬體內可能起一定作用。健康豬隱性攜帶病毒，因此PTTV可通過地區間的生豬貿易和引種等行為而廣泛擴散。

3 討論

TTV是指環病毒屬成員之一，基因組大小為2～4 kb。PTTV的基因組大小為2.7～2.9 kb，目前分為2個不同的基因型(PTTV1和PTTV2)。自2002年日本研究人員[9]分離、鑒定了第1株PTTV(Sd-TTV31株，GenBank登錄號為AB076001)以來，至今共有6株PTTV全基因序列報道，包括4株PTTV1和2株PTTV2，但PTTV1與PTTV2的同源性不到50%[10]。大量研究認為，不同物種TTV的非編碼區序列比較保守，PTTV1和PTTV2的非編碼區也具有保守的基因組序列，因此，目前PTTV的檢測法多為基于此保守序列而建立的PCR(套式PCR或PCR)。1999年，Leary等[11]按照人TTV的非編碼區保守序列設計1對用于檢測豬群中PTTV的引物，結果顯示豬群中PTTV的陽性率為20%。2004年，McKeown等[12]采用按Sd-TTV31株序列建立的PCR法檢測北京附近商業養豬場的20份血清樣品，其中16份存在PTTV感染，這是我國最早報道的PTTV1流行，但未進行分型。隨后，有報道在韓國、泰國、加拿大、美國、法國[13]、意大利[14]及西班牙[5,12,15]等國家豬群中存在PTTV。此外，研究認為PTTV在歐洲野豬中也相當流行[16]。

對于我國豬群中PTTV的檢測，目前有2篇報道。孫泉云等[17]采用熒光PCR檢測隨機采樣的400份豬血清，PTTV感染率為3.75%；王礞礞等[18]采用套式PCR檢測7個省市共258份臨床病料發現，PTTV1的單一陽性率為37.6%，PTTV2的單一陽性率為82.6%，兩基因型的共感染率為38.4%。本研究結果顯示，臨床發病豬中PTTV總陽性率為77.0%，其中PTTV1的單一陽性率為68.6%，PTTV2的單一陽性率為53.9%，兩基因型的共感染率為45.5%。本研究結果中，PTTV1 和PTTV2單獨感染率與王礞礞等的研究結果差異顯著，但共感染率無顯著差異。孫泉云等報道的PTTV在豬群中的低感染率與本研究結果相差甚遠，因為我們檢測到PTTV在健康豬體內也有較高的流行率(43.9%)。原因可能是不同研究中所采用的檢測方法及所采集的樣品不同所致。

關于PTTV的傳播，先前研究認為可能的途徑為糞-口傳播[19]、垂直傳播[20]、子宮傳播[21]、疫苗傳播[8]、性傳播[22]等，本研究中也在母豬血清、公豬精液及死胎中檢測到PTTV，再次證實PTTV可通過精液、子宮等進行垂直傳播。此外，本研究還在健康豬體內檢測到較高的PTTV感染率，提示在進行跨地區引種及頻繁生豬貿易中，健康豬攜帶PTTV可能也是傳播的重要途徑。

目前，在體外還沒有合適的研究PTTV的細胞及動物模型，因此其單獨的致病性尚不清楚。本研究隨機選取來自我國部分省市發病豬和健康豬的樣品進行PTTV檢測，結果顯示發病豬群中PTTV流行率顯著高于健康豬。有研究認為PTTV與仔豬斷奶多系統衰竭綜合征[6]、豬皮炎與腎病綜合征[7]的發生有關。本研究結果初步表明，臨床上PTTV與目前我國復雜的豬病有一定聯系：其單獨感染可能引起感染豬發病，也可能與其他病原產生協同致病作用。目前，PRRSV和PCV2感染在我國豬群中廣泛流行。PTTV在豬群中存在如此高的感染率，極可能會加劇PRRSV和PCV2感染的大流行。因此，PTTV 值得廣大研究者關注，其具體的致病機制需要深入研究。

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