淋巴細胞趨化因子增強柯薩奇病毒DNA疫苗黏膜免疫及預防小鼠心肌炎的作用

岳艷，胡林昆，徐薇，熊思東

復旦大學上海醫學院免疫生物學研究所，上海 200032

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一種臨床常見的心血管系統疾病，近年來在全球范圍內發病呈上升趨勢，且已成為青少年不明原因猝死的主要原因之一[1]?？滤_奇病毒B3型(coxsackievirus B3，CVB3)感染是導致人類急、慢性心肌炎和擴張性心肌病的重要原因[2]，對其預防性和治療性疫苗研制的需求極為迫切。我們的前期工作表明，以具良好生物可容性，促黏膜黏附、吸收及安全無毒等多重優良特性的脫乙酰殼多糖chitosan包裹編碼CVB3結構蛋白VP1的質粒pcDNA3.1-VP1，可制備新型chitosan-DNA(chi-pVP1)黏膜疫苗。該疫苗通過滴鼻免疫可誘導較高水平的CVB3特異性血清IgG和糞便IgA，以及較強的全身細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)應答，可保護33.3%小鼠抵抗致死性CVB3的攻擊[3]。為進一步增強chi-pVP1誘導的黏膜免疫應答，本研究擬從調節黏膜局部微環境、增加免疫細胞數量及功能方面入手，以期獲得更有效的免疫保護力。

趨化因子是一大類具有趨引免疫細胞〔特別是抗原呈遞細胞(antigen-presenting cell，APC)及T細胞〕到達組織局部﹑發揮炎性功能的重要分子群體，其功能研究和應用一直是免疫學的研究熱點[4-6]。研究發現，趨化因子除具有經典的趨化功能外，尚具有抗血管生成，促進淋巴細胞發育和成熟，以及調節局部免疫微環境、誘導免疫應答偏移等多重功效[7]，作為免疫佐劑已廣泛應用于抗感染及腫瘤疫苗等諸多領域[8,9]。C家族趨化因子的唯一成員——淋巴細胞趨化因子(lymphotactin，LTN)主要由活化的CD8+T細胞和自然殺傷(natural killer, NK)細胞分泌。此外，上皮內γδT細胞、CD4-CD8-T細胞、CD4+NK1.1+T細胞也可表達LTN。由于其主要趨化T細胞和NK細胞，因此被認為是淋巴細胞特異性趨化因子[10]。LTN是腸黏膜分泌的最主要趨化因子，在一定程度上提示其可能參與黏膜免疫應答過程。Lillard等將卵清蛋白(ovalbumin，OVA)與LTN蛋白共同滴鼻免疫小鼠，發現LTN可同時促進OVA特異性黏膜Th1和Th2細胞應答，顯著增高黏膜分泌型免疫球蛋白A(secreting immunoglobulin A，SIgA)水平，顯示其作為黏膜免疫佐劑的良好潛能[11]。然而，目前對于LTN能否增強黏膜CTL功能尚不清楚。為此，本研究在原有疫苗體系中引入LTN，利用其趨引免疫細胞、調節局部免疫微環境、促進Th1細胞免疫應答等諸多作用來增強chi-pVP1誘導的特異性黏膜免疫應答及免疫保護效力。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠肌酸激酶(creatine kinase，CK)活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，chitosan(390×103)購自Sigma公司。BALB/c小鼠辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)-羊抗小鼠IgG、IgM購自美國Southern Bio公司。CVB4 VP1237～24913肽及CVB3 VP11～1515肽由上海吉爾生化有限公司合成。亮抑酶肽(leupeptin)、抑肽酶(aprotinin)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)及羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester, CFSE)購自Sigma公司。雄性BALB/c小鼠， 6周齡，購自中國科學院實驗動物中心，清潔級飼養。CVB3 Nancy株由復旦大學附屬中山醫院衛生部病毒性心臟病重點實驗室楊英珍教授提供，在HeLa 細胞中繁殖和擴增，分裝后置-70 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1chi-(pVP1+pLTN)疫苗的制備首先將50 μg pVP1(400 μg/ml)與50 μg pLTN (400 μg/ml)混合，采用復合物共沉淀法，然后在55 ℃水浴中，將0.02% pH 5.7的chitosan溶液逐滴滴入質粒DNA溶液中，同時高速振蕩20 s，即可形成均一、略帶混濁的chi-(pVP1+pLTN) 復合物。

1.2.2免疫小鼠及樣品收集將6周齡BALB/c雄鼠分為chi-(pVP1+pLTN)組、chi-(pVP1+pcDNA3.1)組和chi-pcDNA3.1組，每組6只。輕度麻醉下，將疫苗溶液滴入小鼠鼻孔，免疫劑量為每次各質粒50 μg，隔周免疫，共4次。收集免疫第8周小鼠血清和糞便樣品。小鼠糞便以100 mg/ml溶解于磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)(5%脫脂牛奶、10 mmol/L leupeptin、1 μg/ml aprotinin、1 mmol/L PMSF)，充分混勻后離心，收集上清液，凍存于-70 ℃。

1.2.3血清IgG及糞便IgA的酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測以10 μg/ml VP1237～24913肽包板，4 ℃過夜；PBST(PBS & Tween-20)洗3遍，以1% 牛血清白蛋白(bovine serum album，BSA)-PBS封閉，37 ℃放置2 h；洗3遍，加入100 μ1 1∶40稀釋血清及糞便原液，37 ℃放置2 h；洗3遍，加入100 μ1 HRP-羊抗小鼠IgG、IgA，37 ℃放置1 h；洗4遍，加入100 μ1 鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)底物，避光顯色7 min，加50 μ1 H2SO4(1 mol/L)終止，測A490值。

圖1 免疫小鼠第8周誘生的CVB3特異性血清IgG及糞便IgA水平 Fig.1 The levels of CVB3-specific serum IgG and fecal IgA in immunized mice induced at week 8

1.2.4免疫小鼠腸系膜淋巴結特異性CTL檢測制備正常BALB/c小鼠脾細胞懸液，調整濃度至5×106個/ml，分2份。一份加入CVB3 VP11～15肽(終濃度20 μg/ml)， 37 ℃孵育2 h，然后在室溫下用高濃度CFSE(5 μmol/L)標記；另一份未荷肽的淋巴細胞用低濃度CFSE(0.5 μmol/L)標記，作為體內對照。洗滌后，從2組中各取1×107個細胞，混合后重懸于0.5 ml PBS中，經尾靜脈分別注入各組小鼠體內，18 h后取腸系膜淋巴結行流式細胞術(fluorescence activated cell sorting , FACS)檢測。

1.2.5CVB3感染及心肌組織病理學觀察調整CVB3劑量為3 LD50/0.1 ml，于末次免疫后2周腹腔注射各免疫組小鼠。7 d后取心臟組織行固定、包埋、切片及HE染色，觀察心肌炎癥浸潤及壞死情況，并對其嚴重程度進行分級。+：損傷累及范圍<25%；++：損傷累及范圍25%～50%；+++：損傷累及范圍51%～75%；++++：損傷累及范圍>75%。

1.2.6血清CK活性測定取CVB3感染7 d后免疫小鼠血清20 μl，用定磷法分析測定。

1.3 統計學處理

實驗數據用SPSS 11.5軟件處理，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 chi-(pVP1+pLTN)誘生的CVB3特異性抗體免疫應答

以含每種質粒50 μg的chi-(pVP1+pLTN)、chi-(pVP1+pcDNA3.1)和chi-pcDNA3.1于0、2、4、6周滴鼻免疫小鼠，收集第8周血清及糞便樣品。ELISA檢測結果顯示，chi-(pVP1+pLTN)疫苗誘生高水平的血清特異性IgG和糞便IgA，A值分別達0.66和0.62，顯著高于chi-(pVP1+pcDNA3.1)組的0.58和0.48，提示LTN共滴鼻免疫不僅可提高全身IgG抗體應答水平，還可增加腸道局部 IgA的產生(圖1)。

2.2 chi-(pVP1+pLTN)誘生的腸系膜淋巴結特異性CTL應答

在體內應用CTL實驗檢測chi-(pVP1+pLTN)誘導的CVB3特異性CTL功能。于末次免疫后2周，經尾靜脈注射1∶1混合的荷VP11～15和未荷VP11～15肽段的靶細胞，18 h后取小鼠腸系膜淋巴結進行FACS檢測。結果顯示，chi-(pVP1+pLTN)組誘生的特異性殺傷率達(67.5±7.3)%，顯著高于chi-(pVP1+pcDNA3.1)組的(45.9±4.3)%(P<0.05)，提示LTN共免疫可增強胃腸道黏膜特異性細胞免疫應答(圖2)。

圖2chi-(pVP1+pLTN)誘生的腸系膜淋巴結特異性CTL活性

Fig.2CTLactivityinmesentericlymphnodeinducedbychi-(pVP1+pLTN)

2.3 免疫小鼠心肌病理學觀察

雄性BALB/c小鼠經chi-(pVP1+pLTN)疫苗隔周滴鼻免疫，共4次，于末次免疫后2周，以3 LD50/0.1 ml CVB3經腹腔感染小鼠。7 d后以心肌組織形態特征和病理分級作為評價心肌炎嚴重程度的指標進行評判。結果顯示，chi-pcDNA3.1組小鼠心室內、外壁均出現大量嚴重的灶性壞死，大量心肌細胞被破壞，代之以成團的炎性淋巴細胞浸潤，心肌壞死性損傷比較嚴重 (表1、圖3)。chi-(pVP1+pcDNA3.1)組小鼠心肌壞死性損傷較輕，心肌實質中僅見少量淋巴細胞浸潤和壞死灶，炎癥灶多集中于心內膜下，范圍較大。chi-(pVP1+pLTN)組小鼠心肌損傷最輕，其中僅1只小鼠心內膜下可見少量炎癥病灶且程度較輕；其余5只心肌完全正常，除有細胞濁腫現象和少量淋巴細胞浸潤外，無明顯異常，近似于正常心肌細胞。結果提示，chi-(pVP1+pLTN)新型疫苗滴鼻免疫可有效預防病毒性心肌炎。

表1各免疫組小鼠病毒性心肌炎病理分級

Tab.1Pathologicalgradingofviralmyocarditisinmicereceivingvariousvaccines

Group++++++++++Chi-(pVP1+pLTN)1/60/60/60/6Chi-(pVP1+pcDNA3.1)0/62/60/60/6Chi-pcDNA3.10/61/62/63/6

圖3 3 LD50/0.1 ml CVB3感染7 d時免疫小鼠心肌組織的病理學觀察Fig.3 Histopathological observation of myocardial tissue from immunized mice at day 7 following 3 LD50/0.1 ml CVB3 infection

2.4 血清CK活性檢測及心肌炎發病情況

為進一步觀察chi-(pVP1+pLTN)疫苗的免疫保護效果，我們統計CVB3感染7 d后各組小鼠心肌炎的發病率，并檢測血清CK活性。結果顯示，chi-pcDNA3.1組小鼠100%出現病毒性心肌炎，血清CK活性顯著升高(371 u/ml)，提示有嚴重的心肌細胞損傷；chi-(pVP1+pcDNA3.1)組發病率為33.3%，血清CK活性為125 u/ml，心肌損傷程度較chi-pcDNA3.1組明顯減輕，提示chi-(pVP1+pcDNA3.1)具有一定的免疫保護效果；而chi-(pVP1+pLTN)組僅有16.7%小鼠出現心肌炎，血清CK值也最低，僅為54 u/ml，心肌受損范圍最小，程度最輕，提示pLTN共免疫可增強chi-pVP1基因疫苗的免疫保護效果，更有效地預防病毒性心肌炎的發生(表2、圖4)。

3 討論

黏膜是機體抗感染的第1道防線，同時也是諸多病原體〔如人類免疫缺陷病毒(human immuno-deficiency virus，HIV)、結核分枝桿菌、流行性感冒病毒H5N1等〕入侵的主要門戶。倘若機體不能誘導有效的黏膜免疫應答，病原體會迅速擴散入血，進而侵犯全身，造成機體損傷；同時易發展為慢性感染，導致嚴重致死性疾病。因此如何誘導有效的黏膜局部免疫應答成為近年來免疫學領域的熱點問題，也成為疫苗研制的重要方向和策略[12-14]。研究證實，黏膜途徑給予抗原是誘導黏膜免疫應答最有效的手段。我們前期研究設計的chi-pVP1通過滴鼻免疫可誘生較高水平的黏膜IgA和脾臟CTL應答，具有一定的預防CVB3感染及病毒性心肌炎發生的效果。本研究在原有的chi-pVP1疫苗體系中，引入C家族趨化因子LTN，以期增強黏膜免疫應答，更有效地預防病毒性心肌炎的發生。

圖4 3 LD50/0.1 ml 劑量CVB3感染7 d時免疫小鼠血清CK水平Fig.4 The levels of serum CK in immunized mice at day 7 following 3 LD50/0.1 ml CVB3 infection

表2各免疫組小鼠病毒性心肌炎發生率

Tab.2Incidenceofviralmyocarditisinmicereceivingvariousvaccines

GroupTotal number of miceNumber of diseased miceIncidence (%)Chi-(pVP1+pLTN)6116.7Chi-(pVP1+pcDNA3.1)6233.3Chi-pcDNA3.166100

本研究發現，pLTN滴鼻共免疫可顯著提高chi-pVP1誘導的特異性糞便IgA水平，可能是由于LTN誘導黏膜局部免疫應答偏離，促進Th1和Th2型細胞因子分泌。一方面白細胞介素 4(interleukin 4，IL-4)、IL-6等細胞因子促進抗體類別轉換，促進IgA的產生；另一方面，LTN可能通過上調黏膜上皮細胞膜上IgA受體pIgR的表達，促進IgA轉運[11]。SIgA是黏膜局部重要的免疫效應分子之一，不僅可通過中和作用阻止細菌、病毒等在黏膜局部附著、定植及入侵，還可通過抗體介導的細胞毒作用及調理吞噬作用清除已進入機體循環系統和局部組織的病原體，對抵御病原體感染極為關鍵[15]。因此，誘導高水平的IgA是黏膜疫苗設計的重要目標之一。此外，本研究還發現滴鼻給予pLTN可增強遠端黏膜淋巴組織腸系膜淋巴結的CTL功能。以往研究顯示，用LTN修飾腫瘤疫苗后可上調瘤體局部IL-2、γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)，促進特異性CTL免疫應答[16]；更有學者提出，LTN屬于Th1型趨化因子[17]。我們的工作證實了上述LTN增強CTL功能的觀點和結果，但與以往報道不同的是，本研究將其佐劑效應進一步擴展到黏膜CTL應答的誘導中，即黏膜途徑給予LTN DNA質粒可促進黏膜局部淋巴細胞的殺傷功能，這一結果為增強黏膜免疫應答提供了一種新思路。

由于chi-(pVP1+pLTN)疫苗顯著增強CVB3特異性黏膜免疫應答，有效清除病毒，成功抵抗CVB3的攻擊，因此僅有16.7%的小鼠出現心肌炎癥狀，且心肌損傷程度極輕。與chi-(pVP1+pcDNA3.1)組33.3%的小鼠出現病毒性心肌炎、心內膜下有較多炎癥浸潤等相比，具有顯著差異，提示chi-(pVP1+pLTN)提供了更為有效的免疫保護效果，能更好地預防病毒性心肌炎的發生。本研究為柯薩奇病毒疫苗的研制、LTN作為黏膜疫苗佐劑的進一步探討提供了有意義的基礎。

[1] Esfandiarei M, Suarez A, Amaral A, Si X, Rahmani M, Dedhar S, McManus BM. Novel role for integrin-linked kinase in modulation of coxsackievirus B3 replication and virus-induced cardiomyocyte injury [J]. Circ Res, 2006, 99(4): 354-361.

[2] Fairweather D, Rose NR. Coxsackievirus-induced myocarditis in mice: a model of autoimmune disease for studying immunotoxicity [J]. Methods, 2007, 41(1): 118-122.

[3] Xu W, Shen Y, Jiang Z, Wang Y, Chu Y, Xiong S. Intranasal delivery of chitosan-DNA vaccine generates mucosal SIgA and anti-CVB3 protection [J]. Vaccine, 2004, 22(27-28): 3603-3612.

[4] Allen SJ, Crown SE, Handel TM. Chemokine: receptor structure, interactions, and antagonism [J]. Annu Rev Immunol, 2007, 25: 787-820.

[5] Kuhmann SE, Hartley O. Targeting chemokine receptors in HIV: a status report [J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2008, 48: 425-461.

[6] Miller RJ, Rostene W, Apartis E, Banisadr G, Biber K, Milligan ED, White FA, Zhang J. Chemokine action in the nervous system [J]. J Neurosci, 2008, 28(46): 11792-11795.

[7] Jin T, Xu X, Hereld D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease [J]. Cytokine, 2008, 44(1): 1-8.

[8] Dorgham K, Abadie V, Iga M, Hartley O, Gorochov G, Combadiere B. Engineered CCR5 superagonist chemokine as adjuvant in anti-tumor DNA vaccination [J]. Vaccine, 2008, 26(26): 3252-3560.

[9] Han YW, Aleyas AG, George JA, Kim SJ, Kim HK, Yoo DJ, Kang SH, Eo SK. Genetic co-transfer of CCR7 ligands enhances immunity and prolongs survival against virulent challenge of pseudorabies virus [J]. Immunol Cell Biol, 2009, 87(1): 91-99.

[10] Hedrick JA, Zlotnik A. Lymphotactin [J]. Clin Immunol Immunopathol, 1998, 87(3): 218-222.

[11] Lillard JW Jr, Boyaka PN, Hedrick JA, Zlotnik A, McGhee JR. Lymphotactin acts as an innate mucosal adjuvant [J]. J Immunol, 1999, 162(4): 1959-1965.

[12] Iqbal SM, Kaul R. Mucosal innate immunity as a determinant of HIV susceptibility [J]. Am J Reprod Immunol, 2008, 59(1): 44-54.

[13] Kersten G, Hirschberg H. Needle-free vaccine delivery [J]. Expert Opin Drug Deliv, 2007, 4(5): 459-474.

[14] Yuki Y, Nochi T, Kiyono H. Progress towards an AIDS mucosal vaccine: an overview [J]. Tuberculosis (Edinb), 2007, 87(Suppl 1): S35-S44.

[15] Brandtzaeg P. Induction of secretory immunity and memory at mucosal surfaces [J]. Vaccine, 2007, 25(30): 5467-5484.

[16] Huang H, Bi XG, Yuan JY, Xu SL, Guo XL, Xiang J. Combined CD4+Th1 effect and lymphotactin transgene expression enhance CD8+Tc1 tumor localization and therapy [J]. Gene Ther, 2005, 12(12): 999-1010.

[17] Dorner BG, Scheffold A, Rolph MS, Huser MB, Kaufmann SH, Radbruch A, Flesch IE, Kroczek RA. MIP-1alpha, MIP-1beta, RANTES, and ATAC/lymphotactin function together with IFN-gamma as type 1 cytokines [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(9): 6181-6186.