脂阿拉伯甘露糖聯合38kD蛋白在結核病診斷中的應用

王森，陳嘉臻，張文宏

復旦大學附屬華山醫院感染科，上海 200040

結核病是一種長期危害全人類的慢性傳染病，病死率居傳染性疾病第2位。近年來我國結核病疫情出現加重趨勢。對結核病進行快速、準確的診斷，是控制結核病的重要措施之一。目前結核病確診的主要依據仍然是細菌學檢查(包括培養和涂片)。但結核分枝桿菌(簡稱結核桿菌)培養需很長時間(6～8周)，且10%～20%病例的結核桿菌培養失敗；痰涂片法雖然簡便、快速，但是敏感度很低，平均檢出率只有25%～35%[1]。此外，對于肺外結核(如骨關節結核、淋巴結核等)細菌學檢查陽性率普遍偏低，有時還存在取樣困難。因此這些手段無法對需早期有效治療、疑似結核病的患者進行快速診斷。

自1976年Nassau等[2]用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測抗結核桿菌抗體以來，結核病的血清學診斷方法飛速發展，技術日益成熟，得到越來越廣泛的應用。血清學診斷具有快速、簡便、低廉，且不需要活細胞等優點。血清學診斷抗原方面的研究已取得相當大的進步，并確認了幾個很有希望的血清學抗原。其中，38kD重組抗原作為結核桿菌分泌的一種抗原，是迄今為止確認的抗原中單獨用于結核病血清學診斷效果最好的[3,4]。脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan，LAM)是結核桿菌細胞壁的固有成分，能有效刺激機體產生抗LAM抗體。在本實驗中，我們采用LAM與38kD混合抗原，以ELISA檢測結核病患者血清中抗LAM和38kD混合抗原的IgG抗體(LAM-38kD-IgG)，并與結核菌素試驗(tuberculin skin test，TST)進行比較，以評價其在結核病診斷和篩查中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

1.1.1活動性結核病組共128例，分別來自重慶市肺科醫院(73例)、山東省胸科醫院(20例)和蘇州市第五人民醫院(35例)；男性72例，女性56例；年齡16～84歲，中位年齡46歲；初治101例，復治27例。128例活動性肺結核病患者中，肺結核107例，包括細菌陽性肺結核59例、細菌陰性肺結核48 例；肺外結核21例，包括結核性胸膜炎14例、結核性腦膜炎2例、骨關節結核4例、淋巴結核1例?；顒有越Y核病的診斷標準參考中華醫學會頒布的《結核病臨床診療指南》中的規定，經細菌學檢查、臨床表現及病理確診。

1.1.2潛伏性結核感染組共51例，其中男性23例，女性28例；年齡23～62歲，中位年齡32歲。入選標準如下：①有結核桿菌高感染風險的人群，包括近期與活動性肺結核病患者密切接觸者、可能與結核病患者接觸的醫務人員、來自結核病流行高發區域者等；②酶聯免疫斑點試驗(enzyme-linked immunosorbent spot， ELISPOT)為陽性，本實驗采用T-Spot.TB試劑盒(Oxford Immunotec，Oxford，UK)，由上海復星科技有限公司提供；③根據臨床、影像學表現等排除活動性結核病。

1.1.3健康對照組共68例，分別來自復旦大學附屬華山醫院非結核病體檢者27例和復旦大學志愿者41例。其中男性33例，女性35例；年齡21～68歲，中位年齡31歲。所有入選者無免疫系統疾患，近3個月內未用過免疫抑制劑。

1.2 方法

1.2.1血清LAM-38kD-IgG的檢測選取196例樣本，血清中LAM-38kD-IgG的檢測采用PATHOZYME-MYCO IgG(Myco G)診斷試劑盒(北京邁晨科技有限公司)，完全嚴格按照試劑盒說明書規定的步驟進行操作，酶標儀在450 nm處讀取A值。根據待測樣品的A值，從標準曲線上計算出該樣品的抗體含量。按試劑盒的產品說明，待測樣品抗體水平>400 u/ml判為陽性。所有操作均采用雙盲法。

1.2.2TST采用國產人型結核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)試劑，對所有病例以PPD 0.1 ml(5 TU，1/2 000)皮內注射(通常在前臂掌側)，48～72 h后觀察結果并測量局部硬結直徑。有紅腫硬結且硬結直徑≥5 mm 者或有水皰或破潰者判為PPD試驗陽性，無紅腫硬結者判為陰性。

1.3 統計學處理

所用的統計學分析軟件為Stata(Ver. 10.0)，各組陽性檢出率的比較采用普通卡方檢驗和McNemar卡方檢驗，治療前、后抗體水平的比較采用配對資料t檢驗。

2 結果

2.1 LAM-38kD-IgG檢測對活動性結核病的診斷價值

在本實驗中，活動性結核病患者共128例，LAM-38kD-IgG檢測陽性者60例，敏感度為46.88%。其中肺結核組敏感度為46.73%(50/107)，肺外結核組為47.62%(10/21)。初治組敏感度為45.54%(46/101)，復治組為51.85%(14/27)。肺結核組與肺外結核組，初治組與復治組比較，敏感度均無統計學差異(P>0.05)。在68例健康對照者中，陽性者1例，特異度為98.53%(67/68)。而在51例潛伏性結核感染者中，LAM-38kD-IgG檢測均為陰性(表1)。與臨床診斷結果比較，LAM-38kD-IgG檢測診斷活動性結核病的敏感度為46.88%，特異度為98.53%，陽性預測值為98.36%(60/61)，陰性預測值為49.63%(67/135)。

表1活動性結核組和對照組中LAM-38kD-IgG檢測結果

Tab.1TheresultsofLAM-38kD-IgGtestinactivetuberculosisgroupandcontrolgroup

Cases (n)Positive cases (n)Sensitivity (%)Specificity (%)Pulmonary tuberculosis1075046.73—Extrapulmonary tuberculosis211047.62—Initial tuberculosis1014645.54—Retreated tuberculosis271451.85—Latent tuberculosis510—100Healthy control681—98.53

在107例活動性肺結核病患者中，痰涂片檢查陽性者59例，陰性者48例。涂片陽性組LAM-38kD-IgG檢測的敏感度為52.54%(31/59)；涂片陰性組的敏感度為39.58%(19/48)，低于涂片陽性組，但差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表2涂片陽性和涂片陰性肺結核組中LAM-38kD-IgG檢測結果比較

Tab.2ComparisonofLAM-38kD-IgGtestinsmear-positiveandsmear-negativepulmonarytuberculosis

Smear-positive Smear-negative χ2 PLAM-38kD-IgG positive (n)31191.7860.181LAM-38kD-IgG negative (n)2829Sensitivity (%)52.5439.58

2.2 不同受試人群中血清LAM-38kD-IgG含量的比較

不同受試人群血清中LAM-38kD-IgG的含量及范圍如圖1、2所示，其中肺結核組(包括涂片陽性肺結核和涂片陰性肺結核)和肺外結核組的抗體含量明顯高于潛伏性結核感染組和健康對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。涂片陽性肺結核組、涂片陰性肺結核組和肺外結核組之間，LAM-38kD-IgG含量無顯著性差異(P>0.05)。潛伏性結核感染組與健康對照組比較，血清中LAM-38kD-IgG效價也無顯著性差異(P>0.05)。

Sm+, smear-positive pulmonary tuberculosis (TB); Sm-, smear-negative pulmonary TB; EPTB, extrapulmonary TB; LTBI, latent TB infection.

圖1不同受試人群中LAM-38kD-IgG含量的比較

Fig.1TiresofLAM-38kD-IgGindifferentgroups

Sm+， smear-positive pulmonary tuberculosis (TB); Sm-， smear-negative pulmonary TB; EPTB， extrapulmonary TB; LTBI， latent TB infection.

圖2不同受試人群中LAM-38kD-IgG含量的范圍和平均值

Fig.2RangeandmeantiresofLAM-38kD-IgGindifferentgroups

2.3 LAM-38kD-IgG檢測結果與TST結果的比較

選取96例活動性結核病患者進行PPD皮試，其中PPD反應陽性者(有紅腫硬結且直徑≥5 mm者或有水皰或破潰者)共54例，敏感度56.25%。血清LAM-38kD-IgG檢測陽性41例，敏感度42.71%，略低于PPD試驗，但差異無統計學意義(P>0.05)。在有明確卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)接種史的41例健康對照中，LAM-38kD-IgG檢測的特異度為97.56%(40/41)，而PPD試驗的特異度為41.46%(17/41)，遠低于LAM-38kD-IgG檢測(P<0.01)。如果把PPD和LAM-38kD-IgG檢測結果合并，其中1項陽性即判為陽性，則96例活動性結核病患者中共67例陽性，敏感度可達69.79%(表3)。

表3LAM-38kD-IgG檢測與PPD試驗結果的比較

Tab.3ComparisonofresultsofLAM-38kD-IgGtestandPPDtest

Positive cases in active tuberculosis (n=96)Positive cases in healthy control (n=41)Sensitivity (%)Specificity (%)LAM-38kD-IgG41142.7197.56PPD542456.2541.46

2.4 LAM-38kD-IgG含量與結核病病情的關系

為檢測血清中LAM-38kD-IgG含量與結核病病情之間的關系，我們對部分結核病患者在6個月后進行隨訪。其中23例患者經過規范化抗結核治療后，病情有明顯好轉(臨床癥狀明顯減輕；X線等影像學檢查顯示病變吸收，空洞閉合；痰細菌學檢查轉陰)。其中10例LAM-38kD-IgG檢測陽性患者中7例轉陰，陰轉率為70.0%。對23例患者治療前、后LAM-38kD-IgG含量進行配對t檢驗顯示，治療后抗體水平明顯下降(P<0.05，結果未列出)。

3 討論

近年來研究確認了幾種很有希望的血清學診斷抗原，包括38kD蛋白、α-crystallin(14kD)、16kD蛋白(Rv2031)、Ag85A、Ag85B、MPT64、A60、ESAT-6、CFP-10及LAM等[5]， 但目前還沒有哪一種單獨的抗原在診斷敏感度和特異度方面令人滿意，因此研究者普遍認為血清學診斷試劑可采用幾種不同的抗原以達到較好的診斷效果。本次實驗采用了LAM與38kD蛋白的混合抗原。

128例活動性結核病患者血清中，LAM-38kD-IgG含量的檢測結果顯示其診斷結核病的敏感度為46.88%，與國外用同種試劑盒(Myco G)進行檢測所得的敏感度相似(41%～55%)[6,7]。至于出現假陰性結果，即確診活動性結核病患者的抗體反應呈陰性(53.12%)，主要原因在于不同個體體液免疫水平存在差異；患者處于結核感染的不同階段，如臨床感染初期結核抗體的產生處于“窗口期”；血液中抗原-抗體復合物的存在使抗體無法被檢測等。

本研究結果顯示，LAM-38kD-IgG檢測在涂片陽性肺結核組中的敏感度(52.54%)高于涂片陰性組(39.58%)，盡管無統計學差異，但國外同類實驗證實涂片陽性組檢測的敏感度高于涂片陰性組[8,9]，提示涂片陽性結核病患者體內含有較多結核桿菌，其免疫系統更易受到結核桿菌抗原的刺激，引起較強的免疫反應，產生更多的特異性抗體。此外，LAM-38kD-IgG在肺結核與肺外結核組、初治與復治結核組中的陽性檢出率相似，說明其可被應用于多種類型的結核病如肺外結核病、復治結核病等的診斷。這些特點使LAM-38kD-IgG在檢測不易取得細菌學檢查標本的肺外結核病或細菌陰性肺結核病的診斷方面，具有較高的應用價值。

為避免受到BCG接種的影響，本研究選擇將γ 干擾素釋放試驗(interferon-γ release assay，IGRA)陽性作為潛伏性結核感染的入選標準。Menzies等[10]對1966～2006年相關文獻和數據進行的Meta分析顯示，IGRA檢測的總體特異度為92.5%～97.7%。在BCG接種人群中，其特異度明顯高于PPD試驗(約為56%)。入選的51例潛伏性結核感染者LAM-38kD-IgG含量與健康組相似，但均明顯低于活動性結核病組，提示結核桿菌在潛伏狀態下受機體免疫系統的控制而不能繁殖，較少或不能引起機體的體液免疫反應而產生相應抗體。有文獻證實，機體對38kD抗原的反應主要存在于活動性結核病中，而在潛伏性感染或健康人群中較少引起相應抗體水平升高[9]。為提高對潛伏性結核感染的檢出率，可采用結核桿菌只在潛伏狀態下才表達的標志性蛋白，或在潛伏性感染狀態下能引起相應抗體反應的16kD、14kD抗原等[5]進行檢測。

目前TST仍是我國應用最廣泛的檢測結核桿菌感染的方法。但是，TST中使用的PPD與BCG之間存在交叉反應，出現較高的假陽性率。本研究中，41例BCG接種的健康對照中，TST的特異度僅為41.46%，而LAM-38kD-IgG檢測在健康對照人群中特異度為97.56%，明顯高于PPD試驗(P<0.01) ，且檢測結果不受BCG接種的影響。在檢測結核桿菌感染的敏感度方面，LAM-38kD-IgG檢測略低于PPD試驗，但兩者陽性率無統計學差異。因此，LAM-38kD-IgG檢測是一種替代TST的可行方法，與其他檢測方法聯用可提高診斷活動性結核病的敏感度和準確性。

總之，應用LAM與38kD混合抗原的ELISA技術在診斷活動性結核病方面具有中等敏感度、極高特異度及陽性預測值，不僅可與結核病的其他診斷方法聯用以提高診斷的準確性，而且特別適用于細菌學檢查陰性結核病和肺外結核病的診斷。

[1] Furin JJ, Johnson JL. Recent advances in the diagnosis and management of tuberculosis [J]. Curr Opin Pulm Med, 2005, 11 (3): 189-194.

[2] Nassau E, Parsons ER, Johnson GD. The detection of antibodies to Mycobacterium tuberculosis by microplate enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [J]. Tubercle, 1976, 57(1): 67-70.

[3] Weldingh K, Rosenkrands I, Okkels LM, Doherty TM, Andersen P. Assessing the serodiagnostic potential of 35 Mycobacterium tuberculosis proteins and identification of four novel serological antigens [J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(1): 57-65.

[4] Uma Devi KR, Ramalingam B, Brennan PJ, Narayanan PR, Raja A. Specific and early detection of IgG, IgA and IgM antibodies to Mycobacterium tuberculosis 38kDa antigen in pulmonary tuberculosis [J]. Tuberculosis (Edinb), 2001, 81(3): 249-253.

[5] Abebe F, Holm-Hansen C, Wiker HG, Bjune G. Progress in serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection [J]. Scand J Immunol, 2007, 66(2-3): 176-191.

[6] Imaz MS, Comini MA, Zerbini E, Sequeira MD, Latini O, Claus JD, Singh M. Evaluation of commercial enzyme-linked immunosorbent assay kits for detection of tuberculosis in Argentinean population [J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(2): 884-887.

[7] Senol G, Erer OF, Yalcin YA, Coskun M, Gündüz AT, Bi?men C, Ertas M, Ozkan SA. Humoral immune response against 38-kDa and 16-kDa mycobacterial antigens in tuberculosis [J]. Eur Respir J, 2007, 29(1): 143-148.

[8] Steingart KR, Henry M, Laal S, Hopewell PC, Ramsay A, Menzies D, Cunningham J, Weldingh K, Pai M. Commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: a systematic review [J]. PLoS Med, 2007, 4(6): e202.

[9] Silva VM, Kanaujia G, Gennaro ML, Menzies D. Factors associated with humoral response to ESAT-6, 38 kDa and 14 kDa in patients with a spectrum of tuberculosis [J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2003, 7(5): 478-484.

[10] Menzies D, Pai M, Comstock G. Meta-analysis: new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research [J]. Ann Int Med, 2007, 146: 340-354.