嗜肺軍團菌血清1型基因檢測及分子分型研究

楊 夢,程慧鍵,熊長輝,徐曉倩,陳福輝,劉曉青,周海建,袁 輝

嗜肺軍團菌血清1型基因檢測及分子分型研究

楊 夢1,程慧鍵1,熊長輝1,徐曉倩1,陳福輝1,劉曉青1,周海建2,袁 輝1

目的 了解南昌市賓館業中央空調冷卻塔水中分離的嗜肺軍團菌菌株的基因特征。方法6株分離嗜肺軍團菌菌株分別經血清學凝集試驗、膠乳凝集試驗確定為Lp1型嗜肺軍團菌后,利用 PCR技術對軍團菌屬5SrRNA基因和嗜肺軍團菌mip毒力基因的特異序列進行擴增,應用多位點測序(SBT)分析,獲得相應的SBT型別。使用脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型技術,對菌株進行全染色體DNA酶切電泳分型,并用BioNumerics數據庫軟件進行分型分析。結果所有的菌株均帶有屬特異性5S rRNA基因及mip毒力基因,SBT分型6株菌均為ST1型,PFGE聚類分析結果顯示菌株帶型之間有差異,6株菌可分為4種帶型。結論南昌市公共場所冷卻塔水中分離的Lp1型嗜肺軍團菌菌株基因呈多樣性。

嗜肺軍團菌;血清1型;分子分型

1 材料與方法

1.1 菌株來源 6株Lp1型嗜肺軍團菌均為2006年南昌市6個不同賓館的中央空調冷卻塔水污染狀況監測中檢得,作為PFGE實驗分子量標準對照的沙門菌 H 9812菌株,由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供。

1.2 主要試劑 軍團菌診斷血清購自上海市疾病預防控制中心,GVPC瓊脂、BCYEα瓊脂、無半胱氨酸BCYE瓊脂、膠乳凝集試劑盒購自英國OXO ID生物公司,PCR擴增反應試劑盒購自上海寶生物工程有限公司,均在有效期內使用。7對管家基因引物由上海生工合成,限制性內切酶 SfiⅠ、XbaⅠ、蛋白酶 K購自大連TA KARA公司。

1.3 主要儀器 PCR擴增儀、脈沖場凝膠電泳儀、凝膠成像儀為美國B IO-RAD公司產品,水浴搖床、二氧化碳培養箱為美國NUA IRE公司產品。

1.4 細菌DNA模板制備 挑取單個菌落于100μL裂解液中混勻,于100 ℃煮沸10 min,冰浴5 min,10 000 r/min離心5 min,取上清液做為 PCR擴增的模板。

1.5 PCR擴增 PCR方法參考文獻〔2〕,用5SrRNA和M ip兩套引物分別擴增,循環參數為:94℃5min預變性;94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃60 s,擴增35個循環;最后72℃再延伸5 min。5SrRNA預計擴增片段為130 bp,M ip預計擴增片段為450 bp。產物檢測用1%含 GoldView TMDNA染料的瓊脂糖凝膠電泳,利用DL 2000 DNA Marker確定產物分子量大小。

1.6 多位點測序(SBT) 使用國際 SBT數據庫http://www.ew gli.o rg中公布的引物,對7個基因位點(f la A、pil E、asd、m ip、mom p s、pro A 和 neu A)進行PCR擴增、測序,將得到的序列信息與數據庫中的序列進行比對,獲得相應的SBT型別編號,見表1。

表1 擴增引物序列Table 1 The sequence of primers used in PCR

1.7 脈沖場凝膠電泳 使用 SfiⅠ作為內切酶。分子量標準株 H 9812用 Xba I酶切,其余參數與受試菌株相同。具體步驟如下:用棉簽刮取經培養過夜的適量細菌,均勻懸濁于細菌懸浮液CSB中,使其濃度為5.0個麥氏單位。取400μL細菌懸濁液置于高壓滅菌的1.5 m L離心管中,37℃孵育5 m in后,加入20μL蛋白酶 K(20 mg/mL),用400μL溶解完全且已于 56℃水浴 30 m in以上的 1%Seakem Gold膠(內含1%SDS)混勻后,將混合液加入模具,室溫下靜置15 min,制成膠塊。將膠塊移入5m L細胞裂解液中,54℃水浴搖床(170 r/min)孵育2 h,50℃水浴搖床中使用同溫度純水清洗2次,每次10 min,同溫度 TE buffer清洗4次,每次15 min,清洗后膠塊置 TE中備用。用刀片切下2 mm寬的膠塊放入1.5 m L離心管中,用50 U的SfiⅠ于50℃酶切4 h。將膠塊貼于梳齒包埋于1%Seskem Gold瓊脂糖,待膠凝固后,將膠小心放入含2 500 m L 0.5ⅹTBE緩沖液電泳槽中,電泳21.5 h,電泳起始轉換時間5.3 s,最后轉換時間49.9 s,電壓 6 V/cm,電場夾角 120°,電流控制在155 mA左右,溫度14℃。電泳結束后,將膠塊放入1μg/m L的EB液中染色30 m in,清水脫色1 h后,凝膠成像系統 Gel Doc XR下觀察結果。

1.8 聚類分析 采用BioNumerics軟件對全染色體DNA酶切圖譜進行聚類分析。

2 結 果

2.1 5SrRNA、mip基因PCR檢測結果 6株實驗菌株軍團菌屬特異性5SrRNA基因及嗜肺軍團菌主要毒力基因mip檢測均為陽性(7號菌株為嗜肺軍團菌其它血清型),見圖1。

圖1 5SrRNA,m ip基因PCR檢測結果Fig.1 The PCR results of 5SrRNA and m ip

2.2 SBT分型結果 6株Lp1型嗜肺軍團菌SBT分型均為ST1型,各基因位點等位基因號見表2。

表2 LP1嗜肺軍團菌SBT分型情況Table 2 The sequencing based type result of six Legionella pneumophila serotype 1 strains

2.3 PFGE分型及聚類結果 6株Lp1型嗜肺軍團菌經SfiⅠ酶切后進行 PFGE電泳,得到的圖譜使用BioNumerics軟件處理。按100%的相似性系數進行分型,菌株之間的相似性系數為 72%～100%,6株Lp1型嗜肺軍團菌分為4種不同帶型,見圖2。

圖2 6株LP1型嗜肺軍團菌PFGE結果聚類圖Fig.2 The cluster tree of six Legionella pneumophila serotype 1 strains based on PFGE patterns

3 討 論

自1976年軍團菌被發現以來,已有多起軍團菌暴發及散發病例報道。作為新發傳染病之一,軍團菌病已成為世界各國普遍關注的公共衛生問題。2006年我們對南昌市賓館業中央空調冷卻塔軍團菌污染狀況進行調查,結果顯示,南昌市中央空調冷卻塔存在軍團菌的污染〔3〕,且其污染率高達53.8%,檢出菌型中以Lp1型為主。

PCR方法檢測細菌比已往所有傳統的外顯蛋白質表型檢測更為可靠。5SrRNA是軍團菌屬共有基因,高度保守,其rDNA序列拷貝作為屬檢測依據是非常可靠的。巨噬細胞感染增強蛋白(mip)是軍團菌的主要毒力因子之一,在嗜肺軍團菌抵抗宿主細胞內殺滅機制中發揮重要作用〔4〕,m ip基因序列可用作嗜肺軍團菌種特異性靶序列來擴增。我們應用PCR技術,對 6株Lp1型嗜肺軍團菌進行5SrRNA屬基因和m ip型特異性基因檢測,均攜帶嗜肺軍團菌屬、種基因,從分子角度得以驗證。

Lp1型嗜肺軍團菌是引起人類肺炎最多見的血清型之一。有報道指出,Lp1型菌株包括至少3個血清亞型〔5-6〕,采用常規的血清學分型方法,對于暴發疫情溯源存在困難,因此采用何種分型方法對于結果分析起著關鍵作用。目前應用比較廣泛的核酸指紋分型技術主要是基于電泳圖譜分析的一種分子分型方法,脈沖場凝膠電泳(PFGE)已在國際上廣為應用〔7〕。本次研究中的6株Lp1型嗜肺軍團菌株分別采自南昌市6所賓館的中央空調冷卻塔水,按100%的相似性系數進行分型,從圖2 PFGE聚類圖可以看出,菌株間相似性系數存在差異,說明南昌市賓館業中央空調冷卻塔水分離到的Lp1型嗜肺軍團菌基因存在多樣性。

多位點測序分型(MLST)技術是一種以核苷酸序列分析為基礎的分型方法,它是高通量測序技術和成熟的群體遺傳學相結合的產物。該方法簡單易行,重復性強,能夠反映病原菌的群體進化生物學,在流行病學調查和病原菌的分型鑒定中發揮了巨大作用。可利用MLST方法的高分辨率,進行流行菌株間親緣關系的判定〔8-9〕。但本研究中發現,在Lp1血清型嗜肺軍團菌內,菌株7個管家基因的PCR產物序列均無差異,均為ST1型,即未觀察到位于同一血清型內部的基因突變,揭示了本地區同一血清型內各菌株管家基因堿基序列的高度保守。

中央空調冷卻塔是空調系統中唯一與外界相通的部分,一旦冷卻塔水被軍團菌污染,極易形成氣溶膠,使帶有軍團菌的氣溶膠擴散至空氣中造成空氣污染,同時對周圍環境也存在潛在危害。本研究結果表明,軍團菌分子分型方法可以用于不同賓館軍團菌分子流行病學監測及軍團菌分子遺傳學特征的研究。還可用于研究軍團菌優勢基因型和優勢菌群的分布特征。

(本項研究得到中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所呼吸道室邵祝軍、任紅宇、朱兵清等老師的大力支持和幫助,表示感謝!)

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Genetic characteristics of Legionella pneumophila serotype 1 strains

YANG M eng1,CHENG Hui-jian1,XIONG Chang-hui1,XU Xiao-qian1,CHEN Fu-hui1,L IU Xiao-qing1,ZHOU Hai-jian2,YUAN Hui1

(1.Jiang Xi Provincial Center for Disease Control and Prevention,Nanchang 330029;2.National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102206,China)

In order to determine the genetic characteristics of Legionella pneumophila serotype 1(Lp1)strains isolated from cooling water within towers of central air conditioning in hotels in Nanchang city,six Lpisolates were identified as Lp1 by serological agglutination test and latex agglutination test.Then PCR was used to detect the special Legionella spp.5SrRNA gene and Lp virulence mip gene.Sequencing based type(SBT)and pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)were used in molecular typing.A ll strains were positive with 5SrRNA gene and m ip gene.The SBT typeof all six strainswas ST1.However,the PFGE result showed difference between patterns of six strains,which could be divided into four PFGE patterns.Six Legionella pneumophila isolates from cooling water in towers in public p laces of central air conditioning system s in Nanchang City were genetic diversity.

Legionella pneumophila;serotype 1;molecular typing軍團病是由軍團菌引起的一種機會獲得性呼吸道傳染病。軍團菌目前大約有50個種,72個血清型。90%以上的軍團菌肺炎都是由嗜肺軍團菌引起的,嗜肺軍團菌血清1型菌株(Lp1)為主要的致病血清型。軍團菌的生長和繁殖與環境因素密切相關,尤其在供水系統、空調系統中較為常見〔1〕,主要是通過氣溶膠的方式進行傳播。本研究采用基因檢測、多位點測序、脈沖場凝膠電泳分型技術,對南昌市賓館業中央空調冷卻塔水中分離到的嗜肺軍團菌血清1型(Lp1)菌株進行分子特征研究。

R126.4

A

1002-2694(2010)12-1151-03

袁輝,Email:jxcdcyuanhui@126.com

1.江西省疾病預防控制中心,南昌 330029;2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所,北京

102206

2010-07-11;

2010-09-23