金葡菌對U937細胞XIAP和c IAP1/2表達的影響＊

王佳賀,吳 瓊,王 鑫,何 平

金葡菌對U937細胞XIAP和c IAP1/2表達的影響＊

王佳賀1,吳 瓊2,王 鑫1,何 平1

目的 探討X-相關凋亡抑制蛋白(XIAP)和c IAP1/2在金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)誘導的人巨噬細胞系U 937細胞凋亡中的作用。方法采用Western印跡分析檢測金葡菌感染不同時間后XIAP和c IAP1/2的表達水平;預先用不同濃度的Embelin(XIAP抑制劑)處理U 937細胞60 min,觀察金葡菌感染30 min后U 937細胞的凋亡情況。結果隨著感染時間的延長,XIAP和c IAP1/2的表達逐漸下降。加入XIAP的抑制劑Embelin后,U 937細胞的凋亡率隨著 Embelin的濃度增加而逐漸升高。結論XIAP和c IAP1/2參與了金葡菌誘導的U937細胞凋亡過程。Embelin通過特異性地抑制XIAP表達增加金葡菌誘導的U937細胞凋亡率。

金葡菌;細胞凋亡;U 937;XIAP;c IAP1/2

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)在自然界中廣泛存在,是臨床上常見的主要致病菌之一〔1〕。研究發現,金葡菌可以通過多種機制逃避宿主免疫防御反應并且引起宿主細胞凋亡〔2-4〕。然而,到目前為止,金葡菌引起宿主細胞凋亡的確切機制還不十分清楚。

凋亡蛋白抑制劑(IAPs)家族是近年發現的一類新的細胞內凋亡調控蛋白,至今已發現8個人類IAPs家族成員,其中包括 XIAP和c IAP1/2等,它們在抑制細胞凋亡的過程中起著重要的作用〔5-6〕。其中,XIAP是 caspase的強抑制劑〔7〕。但是,關于金葡菌感染人巨噬細胞系U 937細胞與 XIAP和c IAP1/2是否有關尚未見報道。本研究中,我們探討了X IAP和c IAP1/2在金葡菌誘導U 937細胞凋亡過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞株 金葡菌菌株Wood46由中山大學生命科學學院提供,U 937細胞株由中山大學醫藥生化與分子生物學實驗室饋贈,用含10%小牛血清的RPM I 1640培養基傳代培養。

1.2 主要試劑 Em belin為Sigma公司產品;Annexin V FITC凋亡試劑盒為 RD公司產品;細胞培養試劑購自Invitrogen公司;其它所有試劑均購自Sigma公司。

1.3 準備細菌 金葡菌菌株Wood46按文獻在培養基中培養,離心沉淀細菌,然后用 PBS洗2次。計數金葡菌,用不含抗生素含5%小牛血清的RPM I 1640培養基重懸并稀釋。

1.4 細胞培養及加入抑制劑 U 937細胞在10%小牛血清、2mmol/L L-谷氨酸鈉、100U/m L青霉素、和100 g/m L鏈霉素的RPM I 1640培養基中,于37℃5%CO2的培養箱中培養。在此實驗中的30 min組,在金葡菌感染前60 min加入不同濃度的Embelin。

1.5 金葡菌感染U937細胞 在細菌感染前,用不含抗生素的RPM I 1640培養基將U 937細胞清洗并重懸,濃度調整至2×106/m L,然后當細胞∶細菌為 1∶20時分別培養 0 min、15 min、30 min、60 min和90 min,離心 2次(3 000 r/min,8 min)洗去未吞噬細菌,置于含20%小牛血清、青霉素及鏈霉素的RPM I 1640培養基中培養3 h,獲得感染的U937細胞。

1.6 Western blot U 937細胞經處理一定時間后,用冷的 PBS洗3次,沉淀物在冰上用裂解液重懸20 min。4℃15 000 g離心30 m in,上清即為總的細胞蛋白溶解成分。用12%的SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳。電泳后,用蛋白轉印系統將蛋白轉至PVDF膜上(50 m A 60 min)。用5%的脫脂奶粉在1×三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水中封閉1 h。置于兔抗人一抗(用封閉液1∶2 000稀釋)中1 h。用含0.1%Tween 20洗滌液洗4次,每次 10 min。然后,將膜與過氧化物酶結合的羊抗兔二抗孵化1 h。用增強型化學發光顯色技術顯示蛋白條帶。為了保證同樣數量的蛋白,用麗春紅S染色液染色觀察蛋白帶。用含62.5 mmol/L Tris-HCl(p H 6.7),100 mmol/Lβ-巰基乙醇和2%(V/V)SDS的洗滌緩沖液60℃處理20 min。蛋白帶用光密度掃描法進行定量分析。為保證可重復性,每個Western印跡實驗用2個單獨的膜。在抑制實驗中,U 937細胞在加金葡菌處理前,先用Em belin預處理60 min。

1.7 統計學分析 凋亡率用均數±標準差統計,SPSS10.0統計學軟件進行統計學處理。多組間均數比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較用最小顯著差法。P<0.05具有統計學意義,每組實驗重復3次。

2 結 果

2.1 金葡菌對XIAP和c IAP1/2的影響 金葡菌作用不同時間后,免疫印跡法檢測XIAP和c IAP1/2的表達。結果顯示:隨著感染時間的延長,XIAP和c IA P1/2的表達逐漸下降,見圖1。

圖1 金葡菌感染 U937后XIAP和c IAP/2蛋白的表達Fig.1 The expressions of XIAPand c IAP/2 in S.au reus infected U937 cells＊P<0.05,＊＊P<0.01 compared with that of S.aureus alone

2.2 XIAP在金葡菌誘導的U 937細胞凋亡過程中的作用 用不同濃度的 Embelin預處理U 937細胞,然后用金葡菌誘導U 937細胞凋亡,30 min后收集細胞,用Annexin V FITC/PI雙染后流式細胞儀分析U 937細胞的凋亡情況。結果發現,用Embelin阻斷XIAP后,細胞凋亡率明顯增加,見圖2。

圖2 不同濃度的 XIAP的抑制劑對 U937細胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of different doses of XIAP inhibitor(Embelin)on S.aureus-induced U937 cell apoptosis.＊P<0.05 compared with that of S.aureus alone

3 討 論

IAPs的特殊分子結構及抑制細胞凋亡的功能正日益受到人們的重視。IAP主要有3個結構域,即B IR、RING、CARD 結構域〔8〕。XIAP 為普遍表達蛋白,是 IAP家族中最具有潛在抑制活性的蛋白,它可以直接結合并抑制caspases并可多途徑調節細胞凋亡〔9-10〕。Caspases家族蛋白是調控細胞凋亡發生的關鍵酶,因此XIAP是功能較強的抑凋亡蛋白之一。XIAP分子中的B IR2結構域亦可以獨立地起到完整抑制細胞凋亡的作用。c IAP1/2含有CARD結構域,可直接與腫瘤壞死因子相關因子(TRAFs)-TRAF2結合〔11-12〕。通過 TRAF2 的作用,c IAP1/2被整合到腫瘤壞死因子受體1和2相關的復合體中,調控受體介導的凋亡。

我們過去的研究發現:金葡菌誘導U 937細胞凋亡過程可能與熱休克蛋白70(Heat Shock Protein,HSP70) 及核因子-κB(NF-κB)表達的改變有關;Caspase-3/-9參與了金葡菌誘導的U 937凋亡過程并發揮了重要的作用〔13-14〕。在本研究中,我們應用金葡菌感染所致的凋亡U 937細胞作為研究模型,探討XIAP和c IAP1/2在此過程中的作用。結果顯示,隨著感染時間的延長,XIAP和c IAP1/2的表達逐漸降低。加入XIAP的抑制劑 Embelin后,U937細胞的凋亡率隨著 Embelin濃度增加而逐漸升高。結果表明:XIAP和c IAP1/2在金葡菌誘導的U 937細胞凋亡過程中起到了重要的作用。

金葡菌誘導U 937細胞凋亡的過程包括許多信號轉導通路的共同參與,是一個復雜的過程。了解金葡菌誘導U 937細胞凋亡的確切機制對金葡菌感染的治療將起到非常重要的作用。研究表明,X IAP可以選擇性地激活c-Jun氨基末端激酶(JN K1)。XIAP可能位于NF-κB的下游。金葡菌感染U 937細胞后,XIAP和c IAP1/2與其它信號轉導通路的關系,尚有待進一步探討。

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Roles of XIAP1/2 and c IAP in the apoptosis of U937 cell lines induced by Staphylococcus au reus

WANG Jia-he,WU Qiong,WANG Xin,HE Ping

(Department of Geriatrics,Sheng jing H ospita l,China M edica l University,Shenyang 110004,China)

The aim of this study was to investigate the role of X-linked inhibitor of apop tosis protein(XIAP)and c IAP1/2 in the apop tosisof humanmonocytic U 937 cells induced by Staphy lococcus aureus(S.aureus).U 937 cellswere treated with S.aureus at different time points,and Western blo t were performed to detect the expressions of XIAP and c IAP1/2.The U 937 cells were p retreated with Embelin(an inhibitor for XIAP),and the apop tosis ratesof U 937 cells were detected by Annexin V FITC/PIassay.The results showed that the dow nregulation of XIAP and c IAP1/2 by S.aureus were statistically significant and inhibition of XIAPwith Embelin caused further increase in apoptosis of U 937 cells.It is concluded that XIAP and c IAP1/2 participated in the apop tosisof U 937 cells.Embelin increases U 937 cellsapo ptosis induced by S.aureus via inhibiting the expression of XIAP.

S.aureus;apop tosis;U 937;XIAP;c IAP1/2

R378.11

A

1002-2694(2010)12-1126-03

＊遼寧省教育廳科研課題(L2010701)資助

王佳賀,Email:wangjh1@sj-hospital.org

1.中國醫科大學附屬盛京醫院老年病科,沈陽110004;

2.中國醫科大學附屬盛京醫院涉外醫療服務中心,沈陽 110004

2010-07-12;

2010-10-08