浙江省豬血清中乙腦病毒的分離鑒定及抗體的測定＊

謝榮輝,朱函坪,張曉鋒,徐 芳,楊章女,姚蘋蘋,朱智勇

浙江省豬血清中乙腦病毒的分離鑒定及抗體的測定＊

謝榮輝1,朱函坪1,張曉鋒2,徐 芳1,楊章女1,姚蘋蘋1,朱智勇1

目的 對浙江嘉興地區采集的豬血清進行乙型腦炎病毒分離鑒定以及了解該地區豬感染乙型腦炎病毒的狀況。方法在浙江省嘉興地區采集豬血清標本,利用病毒分離方法檢測豬血清是否攜帶乙腦病毒,利用間接免疫熒光法對豬血清進行抗體檢測。應用熒光定量RT-PCR方法對新分離病毒進行鑒定;設計特異性引物,利用RT-PCR方法擴增新分離乙腦病毒PrM—E基因,并對新分離病毒進行基因分型和 E基因的分析。結果共采集240份豬血清標本,抗體檢測陽性率為61.6%。其中6月中旬50%以上的豬乙腦病毒抗體呈陽性。分離出3株病毒。經熒光定量RT-PCR鑒定3株病毒均為乙腦病毒,基因分析表明3株病毒均屬于基因I型乙腦病毒。對這2株乙腦病毒的 E基因區段進行分析,它們之間核苷酸和氨基酸的同源性均為100%。與疫苗株SA 14-14-2相比,核苷酸同源性在87.7%,氨基酸同源在97.0%以上。結論浙江省嘉興地區豬群中存著乙腦病毒的隱性感染或曾經感染過,提示在該地區自然界中存在著乙腦病毒。

乙腦病毒;E基因;抗體;序列分析

乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),簡稱乙腦病毒,是引起流行性乙型腦炎的病原體。乙型腦炎是以三帶庫蚊為主要傳播媒介的人獸共患病,病毒通常在蚊—豬—蚊等動物間循環,其中豬被認為是乙腦最重要的傳染源和乙腦病毒傳播的主要宿主,在乙腦的流行環節上起重要的作用。因此加強對豬感染乙腦病毒的監測有助于了解乙腦病毒的循環情況,可為預測人群乙腦流行趨勢提供依據。本研究于2008年在浙江省嘉興地區采集豬血清并對其進行病毒分離和抗體檢測,以了解目前乙腦病毒在自然界的情況,為預防和控制該病在人群中的流行提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Taq酶,膠回收試劑盒和X-gal購自 Ta KaRa公司;RNA提取試劑盒購自Qiagen公司,M-MLV逆轉錄酶和質粒載體p GEM-T試劑盒購自Promega公司。乙腦病毒抗原片由本實驗室制備,其他試劑均為分析純。

1.1.2 細胞和培養液 金黃地鼠腎細胞(BHK-21)細胞由中國疾病預防控制中心病毒所提供,細胞培養采用M EM基礎培養基,加10%胎牛血清作生長液,維持液含3%的胎牛血清。

1.1.3 標本來源 2008年5月上旬至8月下旬在浙江省嘉興市海寧豬舍采集2008年初出生的豬血清標本共240份。

1.1.4 豬血清中乙腦病毒抗體的檢測 間接免疫熒光檢測豬血清乙腦病毒總抗體。

1.2 方法

1.2.1 標本處理與接種 將100μL豬血清加入到300μL含500U M EM培養基中,4 ℃12 000 r/m in離心15min。取0.3mL上清液接種于BHK-21細胞中,置37℃吸附1h,棄去殘余液體,加入維持液,于37℃5%CO2培養箱培養,每日觀察細胞病變,連續傳3代,無病變者棄去。

1.2.2 Real-time RT-PCR檢測乙腦病毒 用 Total RNA提取試劑盒(Qigene公司)按說明書提取新分離病毒感染細胞的總RNA。用 TaKaRa公司One Step RNA PCR Kit進行一步法熒光定量RTPCR檢測標本中的乙腦病毒核酸。反應體系:2xOne step RT-PCR buffer III 10μL,上游引物 (20 μmol/L)5′-GGCTCTTA TCACGTTCTTCAAGT TT-3′(239-263)0.2μL,下游引物 (20μmol/L)5′-TGCTT TCCA TCGGCCYAAAA-3′(289-308)0.2μL,探針 (10μmol/L):5′(FAM)-AGCA TTAGCCCCGACCAAGG CG-(TAMRA)-3′(266-287)0.2μL,PrimeScrip tTMRT Enzyme M ix II 0.4μL,Ta KaRa ExTaqTMHS 0.4μL,RNA 模板8.6μL總體積為20μL。充分混勻后。42 ℃逆轉錄10 min,95℃預變性10s,95℃5 s,57℃30 s,40個循環,由儀器自動設置每個循環57℃退火/延伸步驟讀取熒光信號。結果鑒定:在陰、陽性對照均成立時,若病毒在35個循環前有明顯的擴增曲線,則該病毒為乙腦病毒。

1.2.3 病毒PrM和E基因區段的PCR擴增及同源性分析 用Total RNA提取試劑盒Rneasy M ini Kit(Qigene公司)按說明書提取感染病毒的第3代細胞的總RNA。根據已發表的乙腦病毒基因序列合 成 引 物 :P1:5′-CGTTCTTCAAGTTTACAGCA TTAGC-3′,P2:5′-TTAAGCA TGCACA TTGGTCG CTAA-3′利用下游引物 P2以病毒基因組RNA為模板進行RT。反應條件如下:全基因使用MLV逆轉錄酶,參照說明書進行操作。PCR循環參數為94℃預變性 2min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min,30次循環后,72℃延伸10min,最后置于4℃。PCR產物在瓊脂糖上進行電泳后用膠回收試劑盒純化產物并克隆入 T載體送上海生工測序。用Clustal X和DNAstar進行核苷酸和氨基酸序列分析。

2 結 果

2.1 病毒分離 對240份豬血清處理后接種于BHK-21細胞,結果分離到3株病毒,分別命名為JX61、JX66、JX67。這 3株病毒可在 BHK-21細胞中獲得穩定傳代,細胞病變主要表現細胞聚集、固縮并逐漸脫落。

2.2 新分離病毒的熒光定量RT-PCR鑒定 對新分離的病毒提取RNA,進行乙腦病毒熒光定量RTPCR鑒定,經過40個循環擴增,通過分析擴增曲線,發現陽性對照呈現S型,Ct值為10.86,陽性對照成立。正常細胞的陰性對照的擴增曲線為平滑直線,故陰性對照成立。3株病毒的擴增曲線均呈S型,Ct值14.26至17.85之間。均小于35,可判定該3株分離毒株為乙腦病毒。

2.3 豬乙腦病毒抗體檢測結果 用間接免疫熒光法共檢測240份豬血清,有148份陽性,總陽性率為61.6%。5月份豬乙腦抗體水平最低,為21.7%,6、7月漸漸上升分別為63.3%和76.7%,8月最高為91.7%,其中6月份有50%以上的豬血清中乙腦病毒抗體呈陽性。

2.4 新分離病毒的基因分型 采用Chen等建立的基因分型方法對新分離的乙腦病毒進行基因分型鑒定,選擇病毒基因組456～695位,屬于 PrM區的240個核苷酸序列作為基因分型的基礎〔2〕。結果顯示,新分離的3株乙腦病毒均屬基因 I型。與浙江仙居分離株、上海分離株及四川分離株較為相近,見圖1。

2.5 新分離病毒E基因核苷酸及氨基酸分析 采用減毒活疫苗株 SA 14-14-2為標準,對新分離JX61、JX66和JX67的E基因核苷酸及氨基酸進行分析。這3株經熒光定量RT-PCR鑒定為乙腦病毒。3株之間的核苷酸同源性和氨基酸同源性均為100%,與疫苗株的核苷酸同源性87.7%,氨基酸同源性為97.0%。新分離毒株與減毒活疫苗株存在著15個共同的氨基酸差異,分別位于Domain I區的 E-138、E-176和 E-177位,Domain II區的 E-107、E-129、E-222、E-244、E-264 和 E-279 位,Domain III區的 E-315、E327和 E-356位,還有位于這3個活性區外的 E-433、E-439和E447位。新分離的3株乙腦病毒與國內其他基因I型病毒的核苷酸同源性在97.5%～99.3%。氨基酸同源性為98.4%～99.8%。序列比對發現中國各地分離的基因I型乙腦病毒核苷酸及氨基酸的同源性比較高,所有基因I型乙腦病毒之間的核苷酸和氨基酸的差異均不大,但與 II、III、IV之間的核苷酸差異較大,而氨基酸差異并不明顯。

圖1 PrM基因核苷酸序列系統發生樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of Pr Mgene nuclectide sequence

3 討 論

本次調查研究中240份豬血清樣本中乙腦IgG抗體陽性148份,陽性率為61.6%(148/240)。表明豬群中存著乙腦病毒的的隱性感染或曾經感染過,豬可能是嘉興地區乙型腦炎傳播的主要環節之一。研究表明:家豬,尤其仔豬是乙腦的主要擴散宿主,豬血清50%乙腦抗體陽轉時間出現早或晚直接影響著人間乙腦發病情況,因此,監測豬乙腦病毒感染情況是預測人間乙腦疫情的重要手段之一〔3〕。本研究發現:豬乙腦抗體陽性最早在5月份出現,6、7和8月份抗體陽性率逐漸升高,表明乙腦病毒5～8月份已在該地區自然界中開始傳播,這也跟當地80%～90%病例集中在6～8月相符合。且發現豬乙腦血清抗體50%陽轉率出現在6月,而分析近年來浙江省乙腦流行情況表明乙腦發病主要集中在7月,占68.5%;次為 8月,占 17.94%。二者綜合分析表明豬乙腦抗體50%陽轉率3～4w后將出現乙腦發病的高峰期。

本研究從浙江嘉興地區采集的豬血清標本新分離到3株乙腦病毒都屬于基因I型,與浙江仙居、上海、四川、云南、遼寧等地的基因I型乙腦病毒差異不大,表明國內基因I型乙腦病毒具有較高的同源性。

乙腦病毒E蛋白是病毒表面的重要成分,由它形成的表面抗原決定簇,具有血凝活性和中和活性,存在著3個活性結構域,其基因的變異會導致病毒毒力和抗原性的改變〔4-5〕。浙江嘉興分離到的乙腦病毒E基因與疫苗株SA 14-14-2雖然核苷酸的差異較大,但氨基酸同源性較高。新分離株與疫苗株在E蛋白有15個共同的氨基酸位點差異,其中結構域 I有3個,結構域 II有6個,結構域 III有3個。而結構域 III是乙腦病毒中和抗體結合的重要區域 ,特別是 E337-E34、E377-E382、E397-403 區域發生變異會導致抗原性改變,影響抗原與中和抗體的結合反應,通過對比和分析,新分離株與疫苗株在上述區域完全一致,此外在影響病毒毒力的 E138和影響病毒細胞免疫的 E60-E68位均完全一致,提示新分離株抗原性與疫苗株沒有差異,現行的疫苗對新分離株具有預防作用。對中國各地分離的基因I型乙腦病毒核苷酸及氨基酸的同源性比較發現,所有基因I型乙腦病毒之間的核苷酸和氨基酸的差異均不大,但與其他基因型別的乙腦病毒的核苷酸差異較大,而氨基酸差異并不明顯。提示目前的疫苗株理論上能誘導機體產生抗體,并對我國目前的基因I型乙腦流行株提供保護。

〔1〕Tsai TF.New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination:minutes of a WHO/CV 1 meeting,Bangkok,Thailand,13-15 october 1998〔J〕.Vaccine,2000,26(Suppl 2):1-25.

〔2〕Chen WR,Tesh RB,Rico-Hesse R,et al.Genetic Variation of Japanese encephalitis virus in nature〔J〕.J Gen Virol,1990,71(12):2915-2922.

〔3〕陶三菊.流行性乙型腦炎的流行監測及預防〔J〕.中國計劃免疫,2002,8:226-230.

〔4〕Kolaskar AS,Kulkarni-Kale U.Prediction of three-dimensional structure and mapping of conformational epitopes of envelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus〔J〕.Virology,1999,261:31-42.

〔5〕Mason PW,Dalrymple JM,Gentry M K,et al.Molecular characterization of a neutralizing domain of Japanese encephalitis virus structural glycoprotein〔J〕.J Gen Virol,1989,70:2037-2049.

〔6〕Wu SC,Lin CW.Neutralizing pep tide ligands selected from phage displyed libraries mimic the conformational epitope on domain III of the Japanese encephalitis virus envelope protein〔J〕.Virus Res,2001,76(1):69.

Isolation of Japanese encephalitis virusand detection of an tibody against Japanese encephalitis virus in serum of swine from Zhejiang

X IE Rong-hui,ZHU Han-ping,ZHANG Xiao-feng,XU Fang,YANG Zhang-nv,YAO Ping-ping,ZHU Zhi-yong

(Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention,Hangzhou 310009,China)

In order to study Japanese encephalitis virus carried by swine and investigate serum from Jixin region in Zhejinag p rovince antibodies against JEV were tested by IFA.Japanese encephalitis virus in sera were detected by virus isolation.The isolated strains were identified by real time RT-PCR.The Prm-E gene of the isolated viruswasamplified by RT-PCR.The result showed that antibodies against JEV were found in 148 out of 240 serum samples and the total positive rate was 61.6%.Three strains were isolated with cytopathogenic effect(CPE)in BHK-21.The phylogenetic analysis showed that the new isolates belonged to genotype I of JEV.Sequence analysis showed that the homology of nucleo tide sequences and amino acid sequences among three strains were 100%.Compared with the nucleotide sequences between two strains and the JEV vaccine strain SA 14-14-2,the homology was up to 87.7%,and homology of amino acid sequences were up to 97.0%.Compared with the vaccine strain,there were 15 common amino acid sequences in all the three strains.

Japanese encephalitis virus;E gene;antibody;sequence analysis

R373

A

1002-2694(2010)12-1123-03

＊浙江省醫藥衛生科學研究基金資助項目(2008B39)

謝榮輝,Email:ghost_rhxie@hotmail.com

1.浙江省疾病預防控制中心,杭州 310051;2.浙江省農業科學院,杭州 31002

2010-05-20;

2010-09-03