重組PrP102-242在COS-1中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測＊

丁耀忠,劉永生,陳浩泰,劉文倩,張 杰

重組PrP102-242在COS-1中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測＊

丁耀忠,劉永生,陳浩泰,劉文倩,張 杰

目的 重組的PrP102-242在COS-1細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的檢測。方法重組表達(dá)載體pCI-PrP102-242轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞后,經(jīng)不同濃度的 G418篩選后獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系,然后用間接免疫熒光、間接 EL ISA和Western blo t檢測目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果間接免疫熒光、間接EL ISA和Western blot檢測到目的蛋白在COS-1細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)論目的蛋白PrP102-242在COS-1細(xì)胞中的成功表達(dá)為下一步研究PrPc的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。

朊蛋白;COS-1細(xì)胞;間接免疫熒光檢測技術(shù)

牛海綿狀腦病(BSE)是成年牛的一種亞急性、進(jìn)行性、致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,是海綿狀腦病的一種,其致病因子為 PrPSc〔1〕。PrPSc對 PK具有抗性,能被PK降解為分子量約為27～30kD的片段,即PrP27-30,是PrPSc具有感染性的核心片段。有人認(rèn)為,體外大量表達(dá)的重組PrP27-30基因可以在動物體內(nèi)最終發(fā)展成為PrPsc〔2-3〕。Legname等人用PMCA(protein misfolding cyclic amp lification)擴增重組的含淀粉樣纖維的PrP89-230接種轉(zhuǎn)基因小鼠后發(fā)現(xiàn)朊病癥狀〔4〕。

PrP102-242是利用PCR技術(shù)從秦川黃牛腦組織中擴增獲得的,構(gòu)建于pMD-18-T載體上,含有牛PrP27-30全部序列。COS-1細(xì)胞具有準(zhǔn)確的翻譯后折疊及修飾功能,表達(dá)的糖基化藥物蛋白在理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白質(zhì)分子,能使任何復(fù)制啟始位置帶有SV 40的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒以較高的拷貝數(shù)進(jìn)行復(fù)制,而且真核表達(dá)重組載體在COS-1細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)已經(jīng)相當(dāng)成熟〔5-7〕。目前未見PrP102-242在COS-1細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的報道,本研究旨在使 PrP102-242在COS-1細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),以期為PrPC的結(jié)構(gòu)和功能研究以及免疫學(xué)診斷奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 菌株、載體和細(xì)胞株 感受態(tài)大腸埃希菌 E.coli DH 5a購自 Takara公司,C0S-1細(xì)胞購于上海細(xì)胞生物所,pCI-neo載體由本實驗室保存。

1.2 主要試劑和工具酶 限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購自Fermentas公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒均購自Axygen公司,RNeasy M ini kitRNA提取試劑盒購于 Q IANGEN公司;Lipofectam ineTM 2000購自 Invitrogen公司,DMDM培養(yǎng)基為 Hyclon產(chǎn)品,透析胎牛血清為PAA公司產(chǎn)品,G418 Sulfate購Calbiochem公司,PrP(7B6/D2)小鼠多抗 IgG、HRP標(biāo)記的 IgG及 FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠的 IgG均購自 Sigma公司,PureY-iedTMPlasmid M idip rep System質(zhì)粒提取試劑盒由Promega公司提供。其余化學(xué)藥品為國產(chǎn)分析純。1.3 PCR引物設(shè)計 參照 GenBank已發(fā)表的PrP基因序列,設(shè)計兩對引物,上游:5′-ccggaattcgccgccatgggcaaggtggtaccca-3′,加入 Eco RⅠ酶切位點和Kozak 序列 ,下游 :5′-acgcgtcgacctatgctatgcccctcgttggtaataa-3′,加入 SalⅠ酶切位點,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2 方 法

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 從 T載體上進(jìn)行擴增 PrP102-242基因反應(yīng)條件為:95℃5 min→(94℃1 m in→58℃50 s→72℃50 s)×35循環(huán)→72℃10 min。目的基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后用瓊脂凝膠DNA快速純化回收試劑盒回收后備用。

2.1.2 真核表達(dá)重組子的構(gòu)建和鑒定 重組載體構(gòu)建方法同丁耀忠等人報道的方法〔8〕,命名為PCIneo-PrP102-242;對經(jīng) PCR和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定,并用DNA star軟件進(jìn)行序列分析。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及陽性細(xì)胞克隆的篩選

2.2.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、PCR及 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染情況 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、PCR及RT-PCR檢測同丁耀忠等人報道的方法〔8〕。

2.2.2 陽性細(xì)胞克隆的篩選 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h,用含100μg/m L的 G418的DM EM培養(yǎng)基進(jìn)行陽性克隆的篩選,至對照組(未轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞)全部死亡,轉(zhuǎn)染組中剩余的細(xì)胞即為陽性細(xì)胞,待其長滿單層后用胰酶消化后轉(zhuǎn)至新的6孔板中,培養(yǎng)基中 G418濃度提高至200μg/m L、300μg/m L和400 μg/mL繼續(xù)篩選后進(jìn)行后續(xù)檢測。

2.3 表達(dá)蛋白的檢測

2.3.1 間接免疫熒光檢測目的蛋白的表達(dá)和免疫活性 間接免疫熒光檢測同丁耀忠等人報道的方法〔8〕。

2.3.2 間接EL ISA檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá) 篩選中獲得的目的單克隆細(xì)胞為30D1,空載體為5C2為檢測對照,并設(shè)置陽性、陰性和空白對照,待檢測的單克隆細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞裂解處理后進(jìn)行倍比稀釋檢測,一抗為PrP(7B6/D2)小鼠 IgG,二抗為 HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG:

(1)反復(fù)凍融的細(xì)胞4 000r/min離心去除細(xì)胞碎片,p H 9.3的包被緩沖液稀釋細(xì)胞液,每孔50μL,4℃包被過夜后用 PBST洗滌緩沖液洗滌3次,每次5m in,棄液甩干。

(2)每孔加入50μL封閉液,37℃放置1h,同上洗滌。

(3)加1∶300稀釋的 PrP(7B6/D2)小鼠 IgG,37 ℃1 h,同上洗滌。

(4)每孔加入用PBST1∶3 000稀釋的 HRP-山羊抗小鼠IgG,37℃1 h,同上洗滌。

(5)每孔加入50μL顯色液,37℃避光20 min。

(6)每孔加入50μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定OD490值。

2.3.3 Western blot檢測 Western blot參照《精編分子生物學(xué)實驗指南》方法進(jìn)行,一抗為 PrP(7B6/D2)小鼠 IgG,二抗為山羊抗小鼠 IgG,以30D1為檢測目標(biāo),以5C2為對照。

3 結(jié) 果

3.1 重組表達(dá)載體構(gòu)建

3.1.1 PCR結(jié)果鑒定 PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖電泳,結(jié)果顯示擴增出大小約420bp的片段,與預(yù)期片段大小相同,見圖1。

3.1.2 PrP基因的克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建經(jīng)寶生物測序的 PCR產(chǎn)物,登錄 GenBank進(jìn)行基因序列同源性分析(登錄號:EU 553893.1)同源性為98%。重組載體 pCIneo-PrP102-242經(jīng) SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切后,形成大小分別為 420bp和5400bp 2個片段,與預(yù)期結(jié)果相符,見圖2,表明重組真核表達(dá)載體pCIneo-PrP102-242構(gòu)建成功,重組載體構(gòu)建示意圖見圖3。

圖1 PrP102-242PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR analysis of PrP102-242 M:2 000 DNA ladder;1:PrP102-242

圖2 表達(dá)載體pCIneo-PrP102-242雙酶切鑒定Fig.2 The digestion of recombinant plasm id of pCIneo-PrP102-242.M 1:10 000 DNA Ladder;1:pCIneo-PrP102-242;2:SalⅠ+Eco RⅠdigestion of pCIneo-PrP102-242;M 2:2 000bp DNA Ladder

3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及陽性細(xì)胞克隆的篩選

3.2.1 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染后48h,取部分細(xì)胞提取其RNA,用1.3引物進(jìn)行PCR擴增,結(jié)果擴增出了大小為420bp的片段,與預(yù)期結(jié)果一致,而空載體對照組和空白對照組均未擴增出條帶,表明pCIneo-PrP102-242重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功,具有轉(zhuǎn)錄活性。

3.2.2 陽性細(xì)胞克隆的篩選 利用 G418加壓篩選約20d獲得6～10個正常生長的抗性細(xì)胞群。待抗性細(xì)胞長滿6孔板后,用胰酶消化轉(zhuǎn)入新的6孔板,用含有150μg/mL G418的DM EM進(jìn)行篩選繼續(xù)篩選15 d,隨后每4～5 d依次用200μg/m L、300 μg/m L和400μg/m L G418的培養(yǎng)基篩選,2～3 d細(xì)胞即可長滿培養(yǎng)板板底,表明已篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞。當(dāng) G418濃度為500μg/mL的培養(yǎng)基時,篩選細(xì)胞很快死亡,后續(xù)實驗采用400μg/m L的G418用于抗性篩選細(xì)胞。篩選出 PrP102-242基因轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞為30D1和pCI-neo轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞命名為5C2。

圖3 重組載體pCIneo-PrP-27-30構(gòu)建Fig.3 Construction of recombinant plasm id pCIneo-PrP102-242

3.3 檢測結(jié)果

3.3.1 間接免疫熒光檢測 重組質(zhì)粒pCIneo-PrP102-242轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞后利用間接免疫熒光技術(shù)進(jìn)行檢測,在細(xì)胞中觀察到特異性的亮綠色熒光,證明蛋白得到表達(dá),見圖4。

3.3.2 間接EL ISA檢測細(xì)胞中蛋白 檢測一抗、二抗的工作濃度分別為1∶300和1∶4 000,檢測結(jié)果見表1。檢測結(jié)果表明,表達(dá)了重組蛋白的30D1的EL ISA反應(yīng)值較高,1∶4稀釋的細(xì)胞裂解液OD值達(dá)到1.326。

3.3.3 Western blo t檢測結(jié)果 Western blot檢測時,一抗工作濃度為1∶200,二抗為1∶2 000。檢測結(jié)果見圖5、圖6,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的30D1單克隆化細(xì)胞檢測到PrP102-242在18 kD處有特異的反應(yīng)條帶,而對照的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染5C2細(xì)胞則沒有相應(yīng)的條帶,證明所構(gòu)建的在 COS-1內(nèi)表達(dá)的重組PrP102-242具有反應(yīng)原性。

表1 間接EL ISA檢測細(xì)胞中的目的蛋白Table 1 The expression of pCIneo-PrP102-242 by in-EL ISA

4 討 論

利用間接免疫熒光、間接 EL ISA和 Wetern blo t技術(shù)檢測表明 PrP102-242轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞具有反應(yīng)原性,間接 EL ISA檢測結(jié)果表明30D1的EL ISA值較高,但是不同的篩選階段還是有較大差別。說明用G418篩選的不同的陽性細(xì)胞株之間的表達(dá)量差異較大。SDS-PAGE和 Western-blot分析表明30D1表達(dá)分子量分別為18.0kD,Westernblot結(jié)果表明30D1能與PrP單抗(7B6/D2)發(fā)生特異性反應(yīng)。

PrP102-242蛋白能在COS-1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),但是蛋白表達(dá)量并沒有達(dá)到理想的水平〔9-10〕,原因可能是試驗中隨機整合到宿主細(xì)胞的基因組,利用G418加壓進(jìn)行擴增時,周邊序列的擴增可能對細(xì)胞的正常生長產(chǎn)生不良影響等,從而導(dǎo)致不能獲得高表達(dá)細(xì)胞系。另外,我們所選擇的 PrP102-242,不含有氨基端的信號肽和羧基端添加 GPI錨的信號肽,它可能也影響蛋白表達(dá)。

圖6 Western blot鑒定Fig.6 western blot analysis of pCIneo-PrP102-242 M:Protein molecular weight marker;1:5C2 is pCIneo;2:30D1is pCIneo-PrP102-242

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Detection and expression of recombinan t protein PrP102-242 in COS-1 cells

D ING Yao-zhong,L IU Yong-sheng,CHEN Hao-tai,L IU Wen-qian,ZHANG Jie

(Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academ y of A gricultural Sciences,State Key Laboratory of Veterinary Etiological B iology,Key Laboratory of Veterinary Public Health of M inistry of A gricu lture,Key L aboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture,Lanzhou 730046,China)

To detect the expression of product of recombinant protein PrP102-242 in COS-1 cells,purified recombinant protein of PrP102-242 were transfected into COS-1 cells,to obtain stable cell lines using different concentration of G418.After that,the expression of recombinant protein PrP102-242 in COS-1 were detected by using indirect immunity fluorescence assay(in-IFA),indirect enzyme linked imm unoso rbent assay(in-EL ISA)and Western blo t assay.The result showed that expression of pCIp264 in COS-1 were detected by using in-EL ISA,IFA and Western blot.

prion protein(PrP);COS-1;indirect immunofluo rescence

Q786

A

1002-2694(2010)12-1097-04

＊國家自然科學(xué)基金(No.30671563)資助

張杰,Email:scarlettezhang@yahoo.com

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點開放實驗室,農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室,蘭州 730046

2010-07-25;

2010-09-10