人TLR1胞外段原核表達載體的構建、蛋白表達及純化①

年四季 李 祥 黃 黎 曹新梅 周云剛 袁 青 (瀘州醫學院基礎醫學院,瀘州646000)

T oll樣受體(T oll-like receptors,T LRs)是白介素-1受體(IL-1R)超家族成員,是人類進化中高度保守的分子家族,通過識別病原相關分子模式(PAMPs)在先天性免疫反應中發揮著關鍵作用。迄今為止,在人體內已經發現了11種 T LRs。目前對 T LRs研究得比較清楚的是T LR2和T LR4。而對T LR1研究較少,只報道了T LR1分布于各種免疫細胞,如單核細胞、中性粒細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等[1]。T LR1可識別三酰基脂肽,通過T LR1/2異二聚體刺激免疫應答[2,3]。T LR1多態性可調節對脂肽的先天性免疫應答反應和對廣譜致病菌的臨床易感性[4,5]。對于T LR1是否還能識別其他病原微生物產物,其識別機制怎樣,信號傳導機制又是怎樣,還可能對哪些疾病起免疫預防和治療作用等還不清楚。目前,T LR2、T LR4和 T LR9等受體蛋白相繼被表達,并用于受體蛋白對病原分子的識別機制和信號轉導機制研究,關于T LR1受體蛋白的表達,還未見報道。本研究擬擴增T LR1胞外區cDNA,構建含T LR1胞外區基因的pET30a(+)/T LR1重組質粒,轉化 E.coliBL21。并對其進行表達,表達的 T LR1蛋白可用于對病原分子的識別機制及信號轉導機制研究,從而可進一步闡明T LR1相關免疫及炎癥機制,為尋找新的疾病治療途徑與靶點提供思路。

1 材料與方法

1.1實驗試劑 人淋巴細胞分離液購自天津TBD公司,總RNA提取試劑、DNA Marker、凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒均購自北京天根公司;MMLV反轉錄酶、T4 DNA連接酶購自美國 Promega公司,TaKaRa LA Taq DNA聚合酶購自大連寶生物公司;原核表達載體pET30a(+)、E.coliBL21(DE3)和E.coliJM109由本實驗室保存;Ni-NTA純化試劑盒購自美國Invitrogen公司。引物合成由上海博尚生物技術有限公司完成,DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 采集健康志愿者外周靜脈血,按人淋巴細胞分離液試劑盒操作說明分離人外周血單個核細胞(PBMC)。Trizol法提取 PBMC總RNA備用。在 Gene bank中查找人T LR1基因序列,結合原核表達載體pET30a(+)圖譜上的多克隆位點采用Primer Premier 5.0設計1對T LR1胞外區基因擴增引物,并在其中引入酶切位點。上游引物：5′-GTCCCATGGCTACTAGCATCTTCC ATTTT-3′;下游引物 ：5′-ATAGCGGCCGCTTAGTTGCAGG ATAATCCAG A-3′。其中上游引物5′端引入NcoⅠ酶切位點(下劃線表示),下游引物5′端引入NotⅠ酶切位點(下劃線表示)。以提取的人 PBMC總RNA為模板,按常規方法建立逆轉錄反應體系合成cDNA,PCR擴增目的基因。PCR反應條件為：94℃預變性 2分鐘;94℃變性30秒,52℃退火30秒,72℃延伸90秒,30個循環;72℃再延伸10分鐘。1.5%TAE瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物。

1.3重組原核表達載體的構建與鑒定 用NcoⅠ和NotⅠ分別雙酶切純化回收的目的基因片段和pET30a(+)質粒,經氯仿/異戊醇抽提,乙醇沉淀的方法回收酶切質粒和目的片段DNA后,用T4 DNA連接酶連接,轉化感受肽大腸桿菌JM109,篩選陽性克隆,進行PCR鑒定及DNA序列測定。鑒定正確的陽性重組質粒用質粒提取試劑盒純化備用。

1.4T LR1的表達 將測序正確的陽性重組質粒和對照空質粒轉染BL21(DE3),分別于含卡那霉素的平板上挑取生長狀態良好的單菌落,接種到LB(含卡那霉素)培養基中37℃生長至OD600=0.5～0.8,加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導培養5小時后,5 000 r/min離心10分鐘,去上清,收集細菌沉淀。誘導表達后的菌體用1×PBS(pH7.4)重懸后進行超聲波破碎,離心后取上清液和沉淀于上樣緩沖液中100℃煮沸5分鐘,進行SDS-PAGE凝膠電泳,分析目的蛋白的表達。

1.5T LR1重組蛋白的純化和鑒定 pET30a(+)/T LR1重組質粒和空質粒對照菌經IPTG誘導培養后,離心沉淀細菌。按照Ni-NTA純化試劑盒(Invitrogen)中變性條件純化目的蛋白。簡述步驟為：加入鹽酸胍裂解液(6 mol/L鹽酸胍,20 mmol/L NaH2PO4,50 mmol/L NaCl,pH7.8)于菌體中,室溫裂解10分鐘后,再進行超聲波裂解。裂解液8 000 r/min離心15分鐘沉淀細菌碎片,收集上清于Ni-NTA親和層析柱,分別以不同梯度pH值的尿素溶液(8 mol/L尿素,20 mmol/L磷酸鈉,500 mmol/L NaCl,pH7.8、6.0和5.0)洗滌蛋白,最后用pH 4.0尿素溶液洗脫蛋白,SDS-PAGE電泳分析純化蛋白。

1.6Western blot鑒定表達蛋白 將蛋白粗提物進行SDS-PAGE電泳后,轉移至PVDF膜上,4%脫脂奶粉/PBST室溫封閉膜1小時,1×PBST(含0.05%Tween 20)洗滌后,與抗His-tag單克隆抗體(1∶1 000稀釋)室溫反應1小時,1×PBST洗滌后,加入AP標記羊抗鼠 IgG(1∶5 000稀釋)室溫反應1小時,洗滌后,NBT/BCIP顯色。

1.7ELISA鑒定表達蛋白 用純化的T LR1胞外蛋白(50μg/ml稀釋于0.1 mol/L碳酸鹽包被緩沖液中,pH9.6)4℃過夜包被酶標板。次日PBST洗滌酶標板3次后,用封閉液(4%脫脂牛奶溶解于1×PBST中)37℃封閉1小時;洗滌后,加入封閉液稀釋的抗His-tag單克隆抗體(1∶5 000倍稀釋)37℃封閉1小時;洗滌后,加入封閉液稀釋的 HRP標記羊抗鼠單克隆抗體((1∶5 000倍稀釋)37℃封閉1小時;洗滌后,加入底物溶液TMB室溫顯色15分鐘;2 mol/L H2SO4終止顯色,讀取OD450。

2 結果

2.1RT-PCR擴增T LR1胞外段基因 經RT-PCR擴增,產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,于1 700 bp處可見清晰條帶(圖1),其大小與理論值相符。

2.2重組質粒篩選鑒定 T LR1胞外區的PCR產物經NcoⅠ和NotⅠ消化后,與NcoⅠ和NotⅠ酶切的pET30a+載體連接。由于克隆所使用的內切酶為兩個不同的酶,所以連接產物轉化感受肽大腸桿菌JM109后涂含卡那霉素的LB平板,37℃培養過夜,可見平板上有散在單菌落生長,而對照平板上未見任何菌落生長。隨機挑取單菌落,過夜培養(約12～16小時)后提取質粒,以T LR1片段引物進行PCR鑒定,PCR擴增結果與目的片段大小一致(圖2),說明T LR1胞外段基因克隆已基本成功。遂取陽性重組質粒送上海生工生物工程有限公司測序,結果與Genbank公布的T LR1序列一致(GenBank登錄號：NM-003263)。證實插入序列與設計完全相符,成功構建重組表達載體pET 30a(+)/T LR1胞外區基因。

2.3T LR1胞外段蛋白的表達純化 重組質粒轉染大腸桿菌BL21后的陽性表達菌經IPTG誘導后,將誘導表達的菌體進行超聲破碎,離心后取上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳,發現目的蛋白只在沉淀中出現,表明表達的T LR1胞外段蛋白以包涵體形式存在。將表達的蛋白用Ni-NTA親和純化試劑盒中的變性條件純化后,SDS-PAGE電泳結果顯示,純化蛋白呈單一條帶,條帶大小與預期結果相符(約為68 kD),并無明顯雜帶產生,說明純化效果好(圖3)。

2.4T LR1胞外段蛋白的鑒定 將蛋白粗提物進行SDS-PAGE電泳后,轉 PVDF膜,進行 Western blot鑒定。結果顯示,PVDF膜上在68 kD大小處有一明顯條帶產生,與純化蛋白的大小一致,說明表達的T LR1胞外段蛋白正確(圖4)。

2.5ELISA鑒定純化的T LR1胞外段蛋白 將純化的T LR1胞外段蛋白包被酶標板后,由于表達的T LR1胞外段蛋白帶有組氨酸標簽,所以可以用抗組氨酸單克隆抗體進行鑒定。ELISA結果顯示：T LR1蛋白樣品OD450值與陰性對照比例大于2.0,為陽性反應。說明表達的T LR1胞外段蛋白正確(圖5)。

圖1 RT-PCR擴增TLR1胞外段基因Fig.1 Amplification of the extracellular domain of TLR1 by RT-PCR

圖2 PCR鑒定克隆子Fig.2 Identification of clones by PCR

圖3 SDS-PAGE鑒定純化的TLR1胞外段蛋白Fig.3 Analysis of purified TLR1 protein by SDS-PAGE

圖4 Western blot鑒定表達的TLR1胞外段蛋白Fig.4 Analysis of expressed TLR1 protein by Western blot

圖5 ELISA鑒定純化的TLR1胞外段蛋白Fig.5 Identification of purified TLR1 protein by ELISA

3 討論

T LR家族以其獨特的“模式識別”方式,誘導機體產生針對病原微生物成分的天然免疫應答。而天然免疫的激活又可啟動抗原特異性的獲得性免疫應答。因此,T LR對天然免疫和獲得性免疫均有重要的調節作用。盡管T LRs的配體都是PAMP,但不同的T LRs分子對PAMP的識別譜卻不一樣。目前研究發現,T LR2可識別革蘭氏陽性菌的肽聚糖,T LR3主要識別病毒的雙鏈RNA,而在T LR家族成員中,研究最多的是T LR4對革蘭氏陰性菌脂多糖的識別。對于T LR1的研究,目前相關報道較少。本研究表達的T LR1胞外段蛋白可用于分析T LR1與病原分子的作用方式。另外,T LR受體所介導的生物學效應可通過兩種途徑阻斷,一方面胞內段基因突變或缺失,切斷細胞內信號傳導途徑;另一方面在細胞外采用抗T LR單克隆抗體可阻斷對多種激活物所引起的生物學活性,提示T LR識別病原微生物及其產物的結構基礎可能為胞外段結構域[6,7]。本研究通過構建pET30a(+)/T LR1質粒,表達的 T LR1蛋白可用于制備特異于T LR1胞外段的單克隆抗體,并用于封阻T LR1對多種激活物引起的生物學活性,從而進一步研究T LR1與病原體或其產物配體相互作用的識別機制及信號傳導機制。

本研究中表達T LR1胞外段蛋白帶有6個組氨酸標簽,所以采用Ni-NTA親和純化系統對蛋白進行純化,保證了純化蛋白的特異性。另外組氨酸標簽還簡化了表達蛋白的鑒定。在對蛋白進行純化時,用于變性條件下純化蛋白的試劑如細菌裂解液(含高濃度鹽酸胍),以及洗滌液和洗脫液里面含有高濃度的尿素,在保存過程中pH極易發生變化,所以在進行蛋白純化前,需對試劑的pH值進行調整,以保證純化蛋白的純度。本研究中表達的蛋白大部分以包涵體形式存在,在純化過程中采用變性條件進行,在后續應用時需將蛋白進行復性。

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