拘束冷應激對大鼠腎臟熱休克蛋白表達和血清皮質醇含量的動態影響

吳步猛，林飛燕，趙惠玲，黃卡特，林婷婷，包晶瑩，吳軍，方舟溪，陳國榮

(溫州醫學院，浙江 溫州 325035，1.實驗動物中心；2.生命科學學院；3.附屬第一醫院 病理科；4.電鏡室)

拘束冷應激對大鼠腎臟熱休克蛋白表達和血清皮質醇含量的動態影響

吳步猛1，林飛燕2，趙惠玲1，黃卡特3，林婷婷2，包晶瑩2，吳軍2，方舟溪4，陳國榮3

(溫州醫學院，浙江 溫州 325035，1.實驗動物中心；2.生命科學學院；3.附屬第一醫院 病理科；4.電鏡室)

目的：研究拘束冷應激對大鼠腎臟組織熱休克蛋白（heat shock protein 70，HSP70）表達和血清中皮質醇（Cortisol，CORT）含量的動態影響及可能的機制。方法：選取50日齡清潔級大鼠77只，隨機分為7組，即0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h。采用拘束冷應激法，應激相應時間后，用免疫組織化學方法觀察大鼠腎臟組織HSP70的表達，并檢測血清中CORT含量。結果：血清中的CORT濃度在1.5 h呈現最高值，其余各時點變化不明顯。光鏡下可見HSP70在腎小球毛細血管內皮細胞的胞核及腎小管上皮細胞的胞核和胞漿中均有表達。腎臟中HSP70的表達首先呈增加的趨勢，1.5～2.5 h HSP70持續高表達（P＜0.01），之后下降（P＜0.05）。結論：適當強度的拘束冷應激能誘導腎臟組織中HSP70的合成，并且隨著時間的延長而增加，但過度的拘束冷應激則可能降低或阻斷腎臟HSP70的表達。

拘束冷應激；大鼠；腎臟；熱休克蛋白；皮質醇

當動物在各種極端環境因素如雪災、地震等造成的寒冷束縛的刺激下，機體的組織、器官、細胞內會產生各種類型的應激變化，這些變化能夠反映動物的生理狀態和健康狀態。近年來的研究發現，在熱暴露、冷暴露和損傷等應激條件下，一組應激蛋白熱休克蛋白家族（heat shock proteins，HSPs）的表達水平會顯著增加，HSPs在機體內作為一種分子伴侶而對機體起到保護作用[1-2]。以往相關的實驗多基于慢性冷應激，關于急性冷應激對大鼠腎臟組織熱休克蛋白（heat shock protein 70，HSP70）表達的動態影響的文獻并不多見。本研究擬用饑餓后急性的拘束冷應激法對大鼠進行不同強度的應激，用免疫組化法觀察大鼠腎臟組織HSP70的表達，并檢測血清中皮質醇（Cortisol，CORT）含量，以期探討饑餓后拘束冷應激對機體的影響及可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 50日齡清潔級雄性SD大鼠77只，由溫州醫學院實驗動物中心提供[SCXK（浙）2005-0019]，質量180～230 g。隨機分為7組，即分別應激0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h，每組11只。

1.2 拘束冷應激模型制作及標本制作 大鼠禁食不禁水24 h后，將大鼠四肢束縛于網格板上，限制其活動，置于（5±1）℃冰箱內急性冷應激相應時間后取出，用乙醚深度麻醉，開腹、腹主動脈取血、分離血清備用；并快速取3只大鼠腎臟組織2塊，每塊體積約0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，置于10%中性福爾馬林中固定24 h以上，水洗、常規脫水、石蠟包埋，連續切片5μm備用。

1.3 血清CORT含量的檢測 采用免疫放射分析（RIA）法測定大鼠血清CORT含量，由溫州醫學院迪安醫學檢驗中心檢測。

1.4 腎組織HSP70的表達 ABC免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術公司。石蠟切片脫蠟水化，新鮮配制的3% H2O2，室溫下孵育10 min去除內源性過氧化物酶，0.01 nmol/L 枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）熱修復抗原，正常山羊血清封閉20 min；滴加兔多克隆抗體HSP70，稀釋度1:100，4 ℃冰箱過夜；滴加山羊抗兔IgG，37 ℃烤箱孵育30 min，加SABC復合物，37 ℃ 30 min，DAB光鏡下顯色。實驗以0 h組作為陰性對照。結果判定以細胞漿或細胞核染成黃色或棕褐色為陽性判定標準。每張切片隨機選取10個觀察區，采用Image-Pro Plus 5.1圖像處理與分析系統分析免疫組化染色圖像，根據HSP70陽性反應區域的面積（Area）和累積光密度值（IOD）計算每一張圖片HSP70陽性表達量。

1.5 統計學處理方法 組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 血清中CORT含量的變化 前0～1.0 h大鼠血清CORT無明顯變化，1.5 h時達到最高值，之后下降但無持續變化現象。1.5 h組與其他各組之間差異都有顯著性（P<0.05）；其余各組間相比差異都無顯著性（P>0.05）。見表1。

表1 各組血清中CORT濃度的比較（n=8±s）

表1 各組血清中CORT濃度的比較（n=8±s）

與1.5 h組比：*P<0.05，**P<0.01

組別0 h組0.5 h組1.0 h組1.5 h組2.0 h組2.5 h組3.0 h組F CORT（μg/L）19.03±8.51**23.76±4.20*23.98±5.04*46.88±55.09 22.96±6.23*21.78±4.70*22.56±6.08*1.657

2.2 腎臟組織中HSP70表達的光鏡觀察 見圖1。HSP70在腎小球毛細血管內皮細胞的胞核及腎小管上皮細胞的胞核和胞漿中均有表達。0 h組大鼠腎臟HSP70也有表達。隨著冷應激時間的增加HSP70表達量有所增強：0.5 h組HSP70表達量增強不明顯；1.0 h組HSP70的表達量緩慢增強；1.5 h組及2.0 h組HSP70表達量明顯增強，幾乎每個細胞核都有表達；2.5 h組HSP70表達量有所減弱，腎小管上皮細胞內表達范圍有所縮?。?.0 h組HSP70表達量明顯減弱，腎小管上皮細胞內呈局灶性表達。

2.3 腎臟組織中HSP70表達的變化 見表2。各實驗組腎組織中HSP70表達極顯著地高于0 h組（P<0.01）；0.5、0.1 h 組升高但差異無顯著性（P＞0.05），1.5、2.0、2.5和3.0 h組的HSP70表達較0.5、0.1 h組明顯升高（P<0.01）；1.5、2.0、2.5 h組間比較差異無顯著性（P＞0.05），但顯著高于3.0 h組（P<0.05），即隨著拘束冷應激時間持續腎組織HSP70表達持續升高，且至1.5～2.5 h呈高表達穩定狀態，到3.0 h時有所下降。

表2 各組腎臟組織HSP70表達的變化（n=3±s）

表2 各組腎臟組織HSP70表達的變化（n=3±s）

與0h組比：**P<0.01；與0.5h、1.0h組比：##P<0.01；與3.0h組比：△P<0.05，△△P<0.01

Area 44.33±17.99 63.03±32.32**90.57±47.41**176.18± 56.51**##△△176.17± 77.60**##△△173.32± 24.75**##△△139.39±50.30**##△6.024 HSP70 0 h 0.5 h 1.0 h 1.5 h 2.0 h 2.5 h 3.0 h F IOD 7.44±3.36 10.28±5.01**15.46±8.60**29.40 ± 9.70**##△28.71±12.79**##△30.95±3.53**##△23.65±10.32**##6.169

3 討論

圖1 腎臟組織中HSP70表達的光鏡觀察（ABC，×100）

CORT是下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸（HPA）的終末產物，是由腎上腺皮質分泌的一種糖皮質激素，主要調節體內糖和蛋白質的代謝。人們發現各種應激原均可以導致外周血或者是組織CORT升高[3]。本研究顯示，血清中的CORT濃度在1.5 h呈現最高值，其余各時點變化不明顯。此結果與早期相關研究相似[4-5]。HSP70幾乎在所有生物的應激細胞中都經常高度地被誘導表達，HSP70賦予細胞或生物體從應激狀態中恢復的能力，并保護它們免受應激的損害，是對環境和代謝應激綜合反應的代表[6]。饑餓是一種強烈的應激原，拘束冷應激實驗動物模型的制作過程中大鼠需經24 h饑餓處理[7]，導致0 h組也出現HSP70表達。本實驗結果發現，腎臟中HSP70的表達首先呈增加的趨勢，1.5～2.5 h HSP70持續高表達，之后下降，提示拘束冷應激誘導HSP70的大量表達從而對處于應激狀態下的細胞起到一定的保護作用；光鏡下也可以發現幾乎每個細胞核都有表達。本實驗還觀察到，隨著應激時間達到3 h時，腎臟組織中大鼠HSP70表達呈顯著下降，此結果與以往研究并不一致[8]。在實驗過程中，我們注意到拘束冷應激3 h后大鼠都出現體溫下降、虛脫甚至瀕死狀態，提示此時組織中HSP70表達量顯著降低并不是大鼠的“冷適應”，而是機體的衰竭現象，其可能的機制是當嚴重的傷害性應激阻斷了HSP70的轉錄和（或）翻譯過程，HSP70無法合成，不能發揮保護細胞的作用，從而導致機體出現嚴重損傷甚至死亡。

CORT與HSP70之間的關系復雜，尚無定論。Blake等[9]的研究證實，HSP70表達與HPA軸之間存在功能性聯系，束縛應激后3～6 h，大鼠腎上腺皮質及胸主動脈可見HSP70表達；切除大鼠垂體后，束縛應激后未見HSP70表達；但給予ACTH后，又可以誘導HSP70表達。而Vijayan等[10]研究表明，皮質醇水平增高，對肝臟HSP70 表達沒有影響。本實驗結果顯示，大鼠血清中CORT的含量在應激初期就升高，之后變化不明顯，而腎臟HSP70表達量則在應激中后期達到最高，二者間是否存在必然的聯系有待進一步的研究。

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The dynamic effects of cold restraint stress on heat shock protein expression in kidney tissues and serum corticos-teroid content in rats

WU Bumeng*，LIN Feiyan，ZHAO Huiling，HUANG Kate，LIN Tingting，BAO Jingying，WU Jun，FANG Zhouxi，CHEN Guorong.
*Laboratory Animal Center，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To study the dynamic effects of cold restraint stress on HSP70 expression in kidney and serum corticosteroid content in rats，and explore its possible mechanism.Methods:Seventy-seven 50-day-old SD rats were randomly divided into 7 groups，namely 0 h，0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h and 3.0 h group. At corresponding restraint stress time，the expression of HSP70 in kidney tissues were tested by means of immunohistochemistry and the level of CORT in serum was also examined.Results:The level of CORT reached its peak in 1.5 h group，but there was no significant difference in other groups. Under the light microscope， the expressions of HSP70 in the nuclei of renal glomerular capillary endothelial cells，in the nuclei and cytoplasm of renal tubular epithelial cells could be observed. The HSP70 expression in kidney increased continuously first，then it was kept in a high level at stress time of 1.5 h，2.0 h and 2.5 h（P＜0.01），and since then it declined gradually（P＜0.05）.Conclusion:Suitable cold restraint stress can induce the synthetic of HSP70，and it increased with stress time. While excessive cold restraint stress may decreased or block the expressions of HSP70 in kidney.

cold restraint stress；rats；kidney；heat shock protein 70；Cortisol

Q494

A

1000-2138（2010）06-0564-04

2009-10-27

溫州市科技局科技計劃資助項目（Y20060106）；溫州醫學院科技發展基金資助項目（200801052）。

吳步猛（1971－），男，浙江樂清人，高級實驗師。

吳健敏）

·高教研究·