高賴氨酸蛋白基因在大腸埃希菌中的表達

李學琳,高學軍,盧志勇,駱超超,劉曉飛,敖金霞

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

L-賴氨酸是動物的“第一限制性必需氨基酸”[1],對調節體內代謝平衡,提高體內對谷類蛋白質的吸收,改善動物營養,促進生長發育均有重要作用[2]。由于大多數植物蛋白質中賴氨酸含量偏低,以致動物對蛋白質的利用率偏低,若在飼料中添加適量的賴氨酸,可提高蛋白質的利用率。賴氨酸作為重要的飼料添加劑,應用量很大。在玉米籽粒加工、配制混合飼料的過程中必須添加優質蛋白和賴氨酸等飼料添加劑才能滿足畜禽生長發育的需要[3]。在四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)中發現的高賴氨酸蛋白基因,已成功地在多種轉基因植物中表達并提高了賴氨酸含量[4-6],而高賴氨酸蛋白基因是否可以在微生物中表達,進而提高賴氨酸含量,尚未見報道。本實驗前期工作發現益生菌可提高動物的生產性能,可能與其賴氨酸含量有關。本實驗研究高賴氨酸蛋白基因在大腸埃希菌中的表達,為益生菌中表達該基因,進而提高飼料轉化率提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 四棱豆購于河南順強農科院;E.coliRosetta由東北農業大學徐世文教授惠贈;質粒載體pGEX-4T-1由東北農業大學高繼國教授惠贈。

1.1.2 儀器與設備 Trizol購自invitrogen公司;PrimeScript RT-PCR Kit、TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、蛋白質Marker購自大連寶生物科技有限公司;氨芐青霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自上海生工生物工程公司;膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Axygen公司;引物由大連寶生物工程公司合成;其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 四棱豆總RNA的提取 采用Trizol法提取總RNA,cDNA的合成采用試劑盒方法(見寶生物PrimeScript RT-PCR Kit說明書)。

1.2.2 wblys的PCR擴增 根據文獻[7]與Uninted States Patent(登錄號：US 6,184,437 B1)報道的相關序列設計引物。5′端分別引入B amH I酶切位點和SalI酶切位點(下劃線表示),用于wblys基因PCR擴增的引物：上游：5′-CG GGATCC CATTATGGGTGTTTTCACATATGAG-3′;下游：5′-GC GTCGACATTGTATTCAGGATGGGCCAAAAGG-3′。以四棱豆的cDNA為模板,進行PCR擴增,條件如下：94℃預變性5 min;94℃變性50 s,56℃退火60 s,72℃延伸80 s,36個循環;4℃保溫。取5μL PCR產物用于1%的瓊脂糖凝膠電泳。按Axygen凝膠回收試劑盒說明,對PCR產物進行回收純化。

1.2.3 表達載體的構建和目的基因測序 分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切PCR擴增的高賴氨酸蛋白基因片段和質粒pGEX-4T-1,利用T4 DNA連接酶與高賴氨酸蛋白基因片段連接,構建重組質粒pGEX-4T-1/wblys,將pGEX-4T-1/wblys轉化到E.coliRosetta,涂布于含有Ampicillin 100μg/mL的LB固體培養基,采用菌落PCR鑒定出陽性轉化子,送大連寶生物工程公司進行目的基因測序。

1.2.4 wblys的誘導和表達 將陽性轉化子從固體培養基接入含Ampicillin 100μg/mL的20 mL LB液體培養基中,于37℃、200 r/min振蕩培養過夜,以1%的接種量轉接至5 mL新鮮液體LB培養基,繼續于37℃、200 r/min培養至OD600=0.6左右,在37℃下采用1 mmol/L的IPTG誘導4 h。

1.2.5 SDS-PAGE分析 取誘導后的菌體培養液離心收集菌體,重懸于100μL 2×樣品緩沖液中,100℃煮沸,進行SDS-PAGE分析,具體方法參照文獻[8]。

1.2.6 高效液相色譜檢測賴氨酸含量 測定菌株的總賴氨酸含量,取菌體沉淀和上清,按照GB/T 18246-2000[9]中酸水解法進行水解。水解后,定容至25 mL。吸取1 mL濾液,分別置于25 mL具塞離心管中,再分別吸取pH 9.0 Na2CO3-NaHCO3緩沖液2 mL,混勻后,加入CDNB溶液各1 mL,混勻,經0.22μm濾膜過濾后直接上樣,體積10μL,測定其中賴氨酸含量。具體方法參照文獻[9]。

2 結果與討論

2.1 高賴氨酸蛋白基因(wblys)的擴增和測序

PCR擴增出約500 bp的DNA片段,與預期大小基本一致,見圖1。測序結果表明,該片段全長495 bp,與US 6,184,437 B1報道序列的同源性達100%。

圖1 四棱豆wblys基因PCR產物電泳圖譜Fig.1 PCR products ofwblysgene of Psophocarpus tetragonolobus

2.2 表達載體pGEX-4T-1/wblys的構建

宿主的陽性轉化子均擴增出一條約500 bp的條帶,條帶大小符合預測值,并對相應的陽性克隆子進行酶切驗證和測序驗證,結果均完全符合要求,見圖2。

圖2 重組質粒pGEX-4T-1/wblys酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plas mid pGEX-4T-1/wblys

2.3 表達載體pGEX-4T-1/wblys在宿主菌中的誘導表達

經過誘導的重組菌均有比較明顯的重組蛋白表達帶(圖3),重組蛋白的分子質量約為44 ku,與預測的GST融合表達的44 ku的分子質量基本一致。

圖3 大腸埃希菌蛋白表達產物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis ofE.coliprotein induced by IPTG

2.4 細菌發酵液及菌體中賴氨酸含量檢測的結果

誘導前后發酵液中賴氨酸含量幾乎沒有變化,菌體賴氨酸含量檢測的結果見表1。由表1可以看出,誘導后pGEX-4T-1/wblys/Rosetta的賴氨酸含量明顯高于其他組,誘導后菌體總賴氨酸含量比正常菌體提高15.84 mg/g,誘導后pGEX-4T-1/Rosetta的賴氨酸含量顯著低于其他組,可能是由于GST標簽的存在降低了賴氨酸的量。

表1 3種菌體中賴氨酸含量Table 1 The lysine produced in the fermentation broths of 3 kinds of strains

3 結 論

本研究所用的富含高賴氨酸的cDNA為四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus,又名翅豆,winged bean)富含高賴氨酸的編碼蛋白cDNA,從cDNA推論的氨基酸序列可知該蛋白質的賴氨酸含量占10.8%,是這個蛋白質中最豐富的氨基酸[7]。本研究采用轉基因的方法將其轉入大腸埃希菌中,從而使大腸埃希菌中賴氨酸含量提高15.84 mg/g,也是第一次將高賴氨酸蛋白基因由植物轉入微生物中。在本研究中使用的是pGEX-4T-1載體,是原核表達的高效載體,但由于該載體存在GST標簽可能使誘導后pGEX-4T-1/Rosetta的賴氨酸含量下降,具體的原因需要進一步的研究,接下來的研究要實現更高效的表達,本研究成功的為今后開展該基因在益生菌中高效表達并應用于動物生產提供了重要工作基礎。

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