1株虎源致病性腸球菌的分離鑒定及序列分析

李富祥,唐楊春,宋建領(lǐng),王金萍,張 健,李華春＊

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,云南昆明 650224;2.云南省野生動物園,云南昆明 650218)

腸球菌為革蘭陽性球菌,最初歸于鏈球菌屬,直到1984年Schleifer KH等[1]才將其從鏈球菌屬中分離出來作為一個獨立的菌屬,命名為腸球菌屬。腸球菌共包括19個種[2],糞腸球菌(E.faecalis)和屎腸球菌(E.faecium)為其代表種,從臨床標(biāo)本分離的腸球菌以糞腸球菌最為多見,占80%～90%。腸球菌為重要的條件致病菌,可以引起人和動物的心內(nèi)膜炎,膽囊炎,腦膜炎,尿路感染及傷口感染等多種疾病[3]。近年來,在動物醫(yī)學(xué)方面,已報道了腸球菌引起豬、羊、雞、鴨等多種動物疫病[4-7],造成重大經(jīng)濟損失,在獸醫(yī)臨床上,由于抗生素的大量使用,尤其是第3代頭孢菌素的廣泛應(yīng)用,使腸球菌的感染率不斷上升,腸球菌引起的動物疫病也逐漸引起了人們的關(guān)注。目前,腸球菌引起老虎等野生動物疫病國內(nèi)尚無報道。本文報道了1株虎源致病性腸球菌的分離鑒定,并對該菌的生理生化、藥敏試驗、小白鼠致病性實驗、16S rDNA基因序列分析等生物學(xué)特性做了系統(tǒng)研究,對腸球菌感染野生動物疫病流行病學(xué)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 來自云南野生動物園病死老虎的肝臟和肺臟。

1.1.2 主要試劑 16S rDNA通用引物由上海生工合成;細菌基因組提取試劑盒購自上海生工;Taq酶購自大連寶生物公司;15k DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;營養(yǎng)瓊脂、細菌生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司;兔血瓊脂平板和羊血瓊脂平板自制。

1.1.3 實驗動物 昆明系小白鼠、兔購自昆明醫(yī)學(xué)院。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng) 將病料畫線接種于營養(yǎng)瓊脂平板(加入1%葡萄糖),37℃培養(yǎng)過夜,再挑典型單菌落接種于營養(yǎng)瓊脂平板、兔血瓊脂平板、羊血瓊脂平板和營養(yǎng)肉湯37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.2 細菌形態(tài)觀察 分別挑取營養(yǎng)瓊脂平板上單菌落和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物涂片,革蘭染色鏡檢,觀察本菌在固體和液體培養(yǎng)基中的細菌形態(tài)差異。

1.2.3 生化鑒定和抗菌藥物敏感試驗 將本菌純培養(yǎng)物接種于36種細菌鑒定生化管,觀察細菌的生化特性,方法按照使用說明書操作步驟進行。再將本菌純培養(yǎng)物用滅菌生理鹽水稀釋后涂布于營養(yǎng)瓊脂,按美國臨床試驗標(biāo)準(zhǔn)研究所CLSI/NCCLS 1999～2005年頒布的抗菌藥物敏感試驗標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定進行試驗并判定結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)為抑菌圈直徑在15～20 mm為高敏,10～14 mm為中敏,10 mm以下為低敏,0 mm為不敏感(耐藥)。

1.2.4 小白鼠致病性實驗和細菌LD50的測定將純培養(yǎng)細菌稀釋于滅菌生理鹽水制成菌液,用細菌平板記數(shù)法測定菌液的濃度為9×1010cfu/mL,腹腔注射4只小白鼠,0.3 mL/只鼠,并設(shè)肉湯作空白對照,記錄發(fā)病和致死情況,觀察本菌對小白鼠的致病性,剖解病死小白鼠,無菌采肺臟、肝臟做細菌分離培養(yǎng),同時觀察病理變化。在測定最小致死量和最大存活量的基礎(chǔ)上,再將純培養(yǎng)細菌原液(9×1014cfu/mL)做10-3、10-4、10-5、10-6稀釋后,每個稀釋度分別腹腔注射10只小白鼠,0.3 mL/只鼠,觀察小白鼠的發(fā)病情況,觀察14 d,記錄病死數(shù),按Reed-Muench法進行計算細菌的半數(shù)致死量。

1.2.5 16S rDNA核苷酸序列擴增及序列分析按試劑盒操作說明提取細菌基因組DNA,作為PCR模板,按參考文獻[9]報道的16S rDNA引物序列合成一對引物,Pf：5′-AGAGTTTGATCATG GCTCAG-3′(20 bp);Pr：5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′(19 bp)擴增細菌16S rDNA基因片段,50 μL反應(yīng)體系：ddH2O 38.5μL,10×Taqreaction buffer(Mg2+plus)5μL,dNTP(2.5 mmol/L)4 μL,上下游引物各1μL,模板0.25μL,Taq0.25 μL。擴增條件為96℃預(yù)變性3 min(94℃30 s,57℃30 s,72℃90 s)30個循環(huán),72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物送上海生工測序,將測序結(jié)果與GenBank上其他糞球菌進行同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1 細菌培養(yǎng)特性

在營養(yǎng)瓊脂上形成直徑1 mm灰白色小菌落,菌落光滑、濕潤、邊緣整齊。在麥康凱瓊脂上形成較營養(yǎng)瓊脂小的菌落,在血瓊脂上形成較鏈球菌稍大的菌落,在液體培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長,也較易形成長鏈。在綿羊血平皿上不溶血,在兔血平皿上呈α溶血。

2.2 細菌染色特性

革蘭染色呈陽性球菌,常成對、單個或鏈狀排列,少數(shù)成簇排列形似葡萄球菌,無芽胞和莢膜,液體培養(yǎng)物易形成4～12個長鏈狀。

2.3 生化試驗

本菌分解葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、甘露醇、纖維二糖、水楊素、膽汁七葉苷產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,PYR(吡咯垸酮芳胺酶實驗)分解試驗陽性,6.5%NaCl肉湯培養(yǎng)能生長;不分解乳糖、棉籽糖、血清菊糖、阿拉伯糖,木糖、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇、側(cè)金盞花醇;MR試驗陽性;氧化酶、過氧化氫酶、尿酶、H2S、VP試驗、硝酸鹽還原、枸櫞酸鹽、精氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶陰性。

2.4 藥敏試驗

本菌對青霉素G、阿莫西林、氨芐西林、氯霉素等為敏感(S),對頭孢唑啉、頭孢噻吩為中介(I),對阿米卡星、諾氟沙星、氧氟沙星、磺胺甲唑、紅霉素、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素等為耐藥(R),各藥物的抑菌圈直徑大小見表1。

表1 分離菌株對藥物的敏感性Table 1 Drug sensitivty test of the isolated strain

2.5 小白鼠致病性試驗

每只小白鼠腹腔接種2.7×109cfu,在接種菌液后,4只小白鼠均在12 h出現(xiàn)精神沉郁、被毛逆立、站立不穩(wěn)、呼吸急促、黃色水瀉(此癥狀與發(fā)病老虎臨床癥狀相同)等典型臨床癥狀,48 h死亡2只,另外2只小白鼠也在3 d內(nèi)全部死亡,剖檢病死小白鼠可見腸內(nèi)充滿黃色漿液,肝臟重大,肺臟充血、出血。并再次從病死小白鼠肺臟和肝臟分離到相同細菌,表明該株細菌對小白鼠具有較強的致病性。小白鼠接種不同劑量的菌液后,12 h開始出現(xiàn)臨床癥狀,1 d后高劑量組小白鼠開始出現(xiàn)死亡,死亡高峰集中在2～4 d,7 d后停止死亡。各劑量組小白鼠共死亡23只,總死亡率為57%,LD50為109.2cfu,分離菌株LD50計算表見表2。

表2 分離菌株LD50計算表(接種量為0.3 mL)Table 2 The table ofLD50calcualation(Inoculum：0.3 mL)

距離比例=(高于50%的死亡率百分數(shù)-50%)/(高于50%的死亡率百分數(shù)-低于50%的死亡率百分數(shù))=(92.8%-50%)/(92.8%-36%)=0.8

LogLD50=距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%的死亡率的稀釋度的對數(shù)=0.8×(-1)+(-4)=-4.8

LD50=10-4.8/0.3 mL,即將細菌原液(9×1014cfu/mL)稀釋104.8后接種300 mL(2.7×109.2cfu/0.3 mL)可使50%小白鼠發(fā)生死亡。

2.6 16S rDNA核苷酸序列擴增及序列分析

圖1 分離菌株16S rDNA核苷酸擴增產(chǎn)物電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR-amplified 16S r DNA

擴增片段大小在1 000～15 000 bp之間與預(yù)期片段1 415 bp大小相符,擴增正確。將擴增產(chǎn)物送上海生工測序,將測序結(jié)果與GenBank上其它糞球菌進行同源性分析,結(jié)果表明擴增序列與GenBank公布的致病性腸球菌(登陸號為EU285587)同源性為100%,進一步證實該菌株為致病性腸球菌。

3 討 論

糞腸球菌長期以來一直被認為是條件致病菌,在醫(yī)學(xué)上是第二大院內(nèi)感染疾病,已受到高度重視。但在獸醫(yī)臨床上,最近幾年才引起人們的關(guān)注,已報道了腸球菌引起豬、羊、雞、鴨等多種動物疫病。研究表明,致病性菌株和非致病性菌株存在本質(zhì)區(qū)別,Shankar[10]提出糞腸球菌存在著毒力島基因結(jié)構(gòu)。Leavis H[11]也在屎腸球菌中發(fā)現(xiàn)一個毒力島類似結(jié)構(gòu),由7個與細菌調(diào)節(jié)、毒力和抗生素抗性有關(guān)的ORF(溶血素的基因(cyl)、表面蛋白(esp)、心內(nèi)膜炎抗原(efaA)、明膠酶(gelE)等)聚集在一起形成。腸球菌毒力島的存在與其致病性密切相關(guān),后來Coburnd PS[12]研究進一步表明毒力島基因的轉(zhuǎn)錄和表達是強弱毒株的本質(zhì)區(qū)別,毒力島基因前的調(diào)控因子PerA在此過程中發(fā)揮重要作用,決定著腸球菌的致病性。毒力島的發(fā)現(xiàn),使人們認識到糞腸球菌和屎腸球菌致病性正在發(fā)生著某種變化,這也是腸球菌感染越來越受關(guān)注的原因。本菌能使實驗動物小白鼠致死,其LD50為2.7×109.2cfu/0.3 mL,表明本腸球菌分離株對此小白鼠有強致病性,但本菌毒力島基因有待進一步研究。

該分離菌株對青霉素G、阿莫西林、氨芐西林、氯霉素等敏感(S),對頭孢唑啉、頭孢噻吩為中介(I),對阿米卡星、諾氟沙星、氧氟沙星、磺胺甲唑、紅霉素、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素耐藥(R),本菌對大多數(shù)抗生素高度耐藥,與文獻報道的有所差異[7,13],腸球菌耐藥性的改變也與毒力島基因的改變密切相關(guān)。

云南野生物園2只老虎相繼發(fā)病,臨床表現(xiàn)為：黃色水樣腹瀉,體溫升高,呼吸困難,食欲廢絕,消瘦,用第3代頭孢和卡那霉素治療無效,1只老虎發(fā)病3 d后死亡,剖解無菌取肺臟和肝臟,接種營養(yǎng)瓊脂平板,分離到該細菌。根據(jù)藥物敏感結(jié)果,選用敏感藥物青霉素和氨芐西林對另1只老虎進行治療,治療4 d后老虎迅速恢復(fù)健康,取得非常滿意的治療效果。另外,在本菌的小白鼠致病性實驗中,小白鼠接種本菌后也出現(xiàn)了與病虎相似的臨床癥狀,即黃色水樣腹瀉,體溫升高,呼吸困難,并于第2天全部死亡,進一步證實了老虎病因是腸球菌感染,本文報道的糞腸球菌感染老虎并導(dǎo)致老虎死亡在國內(nèi)尚屬首次。

[1] Schleifer K H,Kilpper-Balz.Transfer of Streptococcus faecal is and Streptococcus faecium to Genus Enterococcus nov rev as Enterococcus faecalis combnov and Enterococcus faecium cowbnov[J].Int J Syst Bacteriol,1984,34(1)：31-34.

[2] Quednau M,Ahrne S,Petersson AC,et al.Identification of clinically important species of Enterococcus within 1 day with randomly amplified polymorphic NA(RAPD)[J].Current Microbiol,1998,36(6)：332-336.

[3] Gilmore M S.The enterococcus：pathogenesis,molecular biology and antibiotic resistance[M].AS M Press,Washington D C,2002,385-408.

[4] 劉磊,王亞賓,程金平,等.豬源腸球菌兩種致病基因和表型的檢測[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2009,25(1)：17-20.

[5] 周霞,程安春,汪銘書,等.致羔羊腦炎糞腸球菌分離鑒定及毒力因子基因的PCR檢測[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2008,28(1)：35-39.

[6] 苑麗,付秀玲,劉建華,等.1株鶉雞腸球菌產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的基因型鑒定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2009,29(7)：858-863.

[7] 韓梅紅,谷長勤,胡薛英,等.4鴨源腸球菌的鑒定和致病性[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2007,27(6)：821-829.

[8] 殷震,劉景華.動物病毒學(xué)(第2版)[M].北京：科學(xué)出版社,1997：329-331.

[9] Martin F.Polz,Colleen M.Cavanaugh.Bias in template to product ratios in multitemplate PCR[J].Appl Environ Microbiol,1998,64(10)：3724-3730.

[10] Shankar N,Baghdayan AS,GilmoreMS.Modulation of virulence within a pathogenicity island in vancomycin-resistam Enterococcus faecalis[J].Nature,2002,417(6890)：746-750.

[11] Leavis H,Top J,ShankarN,et al.A novel putative enterococcal pathogenicity island linked to the esp virulence gene of Enterococcus faecium and associated with epidemicity[J].J Bacteriol,2004,186(3)：672-682.

[12] Coburn PS,Baghdayan AS,Dolan GT,et al.An AraC-type transcriptional regulator encoded on the Enterococcus faecalis pathogenicity island contributes to pathogenesis and intracellular macrophage survival[J].Infect Immun,2008,76(12)：5668-5676.

[13] Hwang IY,Ku HO,Lim SK,et al.Species distribution and resistance patterns to growth-promoting antimicrobials of enterococci isolated from pigs and chickens in Korea[J].J VetDiagn Invest,2009,21(6)：858-862.