真菌營養親和群鑒定方法的改進

陳 強,張金霞

(中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所,北京 100081)

真菌營養親和現象反映的是同種群體內個體的表型差異(或相似性)[1]。而真菌種內擁有相同的異核體(heterokaryon,het)或營養不親和(vegetative imcompatibility,vic)位點的個體(基因型)能夠融合形成異核體[2],能形成穩定異核體的真菌個體被認為屬于相同的營養親種群(vegetative compatible group,VCG)。相反,存在一個或多個het或vic位點差異的個體不能融合,菌絲細胞接觸出現程序性死亡或凋亡的個體屬于不同的VCG[1,3]。某些真菌的菌絲分泌色素或顏色深,如葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)和Cryphonectriaceae科的多數種,菌絲不能融合,在不同的個體間能觀察到一條溝帶,對于這些種而言,在培養皿上測試它們的親緣關系,很容易確定它們的VCG,它可以為研究群體多樣性提供一個有力的視角[4-5]。對于菌絲的顏色淺的某些真菌,如鐮刀菌(Fusarium)中的種,屬于不同VCG的個體間的溝帶很難辨認,它們需要構建nit突變體才能確定個體[6-7]。真菌VCG是研究物種起源、進化和群體分化的一種有效手段。應用營養不親和反應可用來鑒定菌株,特別是在食用菌生產實踐中應用比較廣泛,一般認為：2個菌株對峙培養,若發生營養不親和反應,則可以認定它們為不同的菌株;若它們營養親和,則不能判定它們相同,需要采用其他方法進一步鑒定。在日本的香菇、平菇、肺形側耳、杏鮑菇、毛木耳、金針菇、滑菇、黃傘、灰樹花、斑玉蕈、真姬菇、荷葉離褶傘、茶樹菇和磚紅離褶傘等14種食用菌新品種DUS(Distinctness、Uniformity、Stability,特異性、一致性、穩定性)測試指南中,營養不親和反應均是測試項目之一。目前鑒定營養親和群的方法通常是將群體內的個體兩兩配對,觀察個體的接觸區域是否產生溝帶或分泌色素,這個方法簡單而且成本低,但是它的缺點就是工作量大,1個菌株要與群體中其他的每個菌株兩兩配對,若有N個菌株,則需要的配對是C2N個,當N＞100時,配對的組合數超過5 000,工作量非常大。本文改進配對方法,減少配對的工作量,大大減少培養皿和培養基的使用量,節約材料和時間,提高配對效率。

1 材料與方法

1.1 材料的處理

以香菇Lentinula edodes為例,取7個菌株241、879、892、898、910、917、923,將它們分別接種PDA培養基上,25℃培養活化。

1.2 試驗設計

取3個裝有PDA培養基的培養皿(直徑9 cm)。剪一個邊長3 cm的正六邊形紙片,紙片中心留有小孔。把紙片蓋在培養皿底的外表面,用記號筆在培養皿底上標記正六邊形的頂點和中心。將菌株241、879、892、898、910、917、923按序號從小到大重新依次命名為A、B、C、D、E、F、G,按照圖1的順序,取相同大小的菌種塊(直徑0.4 cm左右),分別接種于3個培養皿的相應的位置,25℃培養,培養皿正置。

圖1 供試菌株接種點示意圖Fig.1 Illustration of sites of tested strains inoculation

2 結 果

采用圖1的實驗設計,7個菌株兩兩間的配對接觸次數見表1。能夠保障每個菌株之間至少1次兩兩接觸,完全能夠正確反應出7個菌株之間營養不親和關系。實例證明(如圖2),采用3個培養皿就能判定7個菌株兩兩之間的營養不親和性。

表1 供試菌株接觸次數Table 1 Pair times of tested strains

圖2 香菇7個菌株營養不親和反應Fig.2 Vegetative compatible relations of sevenLentinula edodesstrains

3 討論與結論

采用本文設計的方法,在香菇、平菇、白靈菇鑒定營養不親和試驗中得到了滿意的效果,大大縮小了工作量。當菌株比較多時,可以將7個菌株為一組,分成若干組,同時從每組中取出1個菌株,組成新的一組(若菌株不夠7個,可以將菌株重復若干次湊成7個),按照以上的方法分別判定組內菌株的營養親和關系。假設菌株的營養親和關系是可以類推的,即菌株A分別與B、C親和,則推測B與C親和。將營養親和群內的菌株只保留1個,與其他營養親和關系未確定的菌株一起,按照以上的方法,繼續判斷,直到所有菌株的營養親和關系明確為止。由于并非所有的營養親和關系都能類推,在點柄粘蓋牛肝菌(Suilus granulatus)中曾發現組織分離物VT1993與VT1990、VT1994營養親和,而VT1990與VT1994營養不親和[8]。但是這種現象很少見,仍可以假定營養親和關系可以類推。對于推測營養親和的菌株,再次配對即可驗證。在運用此方法時,要掌握如下要點：若菌株生長速度慢,則需要把培養基倒厚些;若有條件,可能用封口膜封口,以防培養基失水過多而影響結果;同一組的7個菌株,盡量挑選生長速度相近的菌株,接種塊大小盡可能一致,以防生長快的菌株侵占生長慢的菌株的生長空間,造成觀察不便;同一組的7個菌株實在是生長速度差異比較大,則可以先接種生長慢的菌株,隔一段時間接種生長快的菌株。

[1] Leslie JF.Fungal vegetative compatibility[J].Annual Review of Phytopathology,1993,31：127-150.

[2] GlassNL,JacobsonDJ,Shiu PKT.The genetics of hyphal fusion and vegetative incompatibility in filamentous ascomycete fungi[J].Annual Review of Genetics,2000,34：165-186.

[3] Anagnostakis SL.Chestnut blight：The classical problem of an introduced pathogen[J].Mycologia,1987,79(1)：23-37.

[4] Burgess T,WingfieldBD,WingfieldMJ.Comparison of genotypic diversity in native and introduced populations of Sphaeropsis sapineaisolated from Pinusradiata[J].Mycological Research,2001,105(11)：1331-1339.

[5] Van Heerden S W,Wingfield MJ.Genetic diversity of Cryphonectria cubensisisolates in South Africa[J].Mycological Research,2001,105(1)：94-99.

[6] Klittich CJR,Leslie JF.Nitrate reduction mutants ofFusarium monilifor me(Gibberella fujikuroi)[J].Genetics,1988,118(33)：417-423.

[7] Swift CE.Vegetative compatibility groups of Fusarium oxysporumf.sp.cepaefrom onion in Colorado[J].Plant Disease,2002,86(6)：606-610.

[8] KathrynMJ,Orson K M,Bruce JT.Randomly amplified polymorphic DNA markers are superior to somatic incompatibility tests for discriminating genotypes in natural populations of the ectomycorrhizal fungus Suillus granulatus[J].PNAS,1993,90：9159-9163.