膠原模擬多肽三螺旋結(jié)構(gòu)的熱變性過程

劉 劉玲蓉陳名懋楊文智張其清

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程研究所天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點實驗室,天津 300192

2廈門大學(xué) 材料學(xué)院生物材料系生物醫(yī)學(xué)工程研究中心福建省生物醫(yī)學(xué)工程重點實驗室,福建廈門 361005

膠原模擬多肽三螺旋結(jié)構(gòu)的熱變性過程

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程研究所天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點實驗室,天津 300192

2廈門大學(xué) 材料學(xué)院生物材料系生物醫(yī)學(xué)工程研究中心福建省生物醫(yī)學(xué)工程重點實驗室,福建廈門 361005

膠原蛋白;三螺旋結(jié)構(gòu);熱變性

DO I:10.3881/j.issn.1000-503X.2010.03.023

氨基酸重復(fù)序列是很多纖維狀蛋白質(zhì)特征,這些序列促進每種蛋白形成自己的拓撲結(jié)構(gòu)[1]。膠原蛋白 Gly-X-Y肽段的重復(fù)出現(xiàn)使得膠原二級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)特征性的聚脯氨酸Ⅱ型 (P2)結(jié)構(gòu),P2結(jié)構(gòu)進一步形成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu),這是膠原蛋白區(qū)別于其他蛋白質(zhì)的特征性結(jié)構(gòu)[2]。膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)在機體生命活動中發(fā)揮著極為重要的作用,膠原缺失及三螺旋結(jié)構(gòu)改變會導(dǎo)致多種人類疾病發(fā)生[3]。本研究以具有氨基酸重復(fù)序列的膠原模擬多肽 (collagen mimetic peptides,CMP),即 (Gly-Pro-Hyp)7作為膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)模型分子,采用圓二色譜和傅立葉紅外光譜兩種光譜學(xué)方法對其三螺旋結(jié)構(gòu)及熱誘導(dǎo)變性過程進行研究,旨在進一步認識膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)受溫度影響的相關(guān)機制。

材料和方法

材料和儀器 CMP(上海吉爾生化有限公司),D2O (青島騰龍微波科技有限公司),CaF2窗片(32 mm×3 mm,天津港東科技有限公司);JASCO J-810圓二色譜儀 (日本 JASCO公司),Nicolet IS-10系列傅立葉變換紅外光譜儀 (美國 Nicolet公司)。

圓二色譜分析 配制濃度為 0.2 g/L的 CMP重水稀溶液,將其注入 1 mm光徑的石英池,于 190～260 nm范圍內(nèi)進行掃描,各參數(shù)設(shè)定如下:分辨率0.1 nm,掃描速率 100 nm/min,狹縫寬度 1 nm,響應(yīng)時間 1 s,靈敏度 standard(100 mdeg),記錄結(jié)果為 3次掃描平均值。

傅立葉紅外分析 將 CMP溶于重水配制終濃度為 5 g/L的溶液,將 CMP溶液于 4℃放置 48 h后進行紅外光譜檢測。光譜采集采用 Nicolet公司液體變溫附件,窗片之間距離為 25μm,將 40μl樣品溶液注入 CaF2晶體窗片之間后密封。掃描條件設(shè)置為:掃描次數(shù) 64次,分辨率 2 cm-1,在不同溫度條件下測量 CMP溶液位于 1 700～1 600 cm-1的光譜。得到的譜圖在OM I NC軟件下進行數(shù)據(jù)處理,應(yīng)用溶劑峰差減和傅立葉去卷積等方法進行數(shù)據(jù)處理,對處理后紅外譜線進行高斯/洛侖茲擬合。

結(jié) 果

圓二色譜分析結(jié)果 20℃時,CMP正峰出現(xiàn)在約 225 nm處,負峰出現(xiàn)在約 198 nm位置;隨著溫度升高,正負峰強度均有所減少并發(fā)生紅移,負峰紅移幅度大于正峰 (圖 1)。225 nm處 CD值-溫度曲線在 30～50℃范圍內(nèi)發(fā)生明顯突躍;20℃時 CMP的圓二色譜譜峰正峰強度與負峰強度比值 (Rpn值)為0.104;升至 30℃以上時 CD譜峰型發(fā)生強烈改變,正峰和負峰強度都急劇減小,Rpn值也大幅度降低;50℃以后 Rpn值降低幅度減緩;80℃時降至 0.01;Rpn值-溫度曲線的突躍中點約為 43℃,與 225 nm處CD值-溫度曲線重疊效果良好 (圖 2)。CMP在冷卻過程中后其正負峰強度均有大幅度提高,負峰明顯藍移,CMP發(fā)生 “單體-三螺旋”轉(zhuǎn)變;4 h后整個譜型與加熱前相比幾乎一致,Rpn值由最初的 0.01升至 0.106(圖 3)。

傅立葉紅外光譜分析結(jié)果 CMP紅外光譜酰胺Ⅰ帶吸收結(jié)果顯示,1 645 cm-1和1 672 cm-1處有兩個明顯主峰,1 630 cm-1處有 1個肩峰;隨著溫度升高,1 645 cm-1處的吸收強度明顯降低,但沒有明顯峰位移現(xiàn)象發(fā)生,1 630 cm-1和1 672 cm-1處吸收強度降低幅度不大 (圖 4)。FTIR-溫度曲線顯示,15℃時 CMP在1 645 cm-1處具有最強吸收值 0.071,30℃以后吸收強度下降趨勢加快,60℃時吸收強度已降至 0.045,整個酰胺Ⅰ帶的吸收強度隨溫度升高逐漸降低,與圓二色譜所表示的熱變性曲線具有相同的突躍區(qū)間并重疊情況良好,可得出變性溫度 Tm≈42℃(圖 5)。FTIR反應(yīng)的 CMP復(fù)性結(jié)果顯示,冷卻過程中1 645 cm-1處的吸收強度逐漸增強,4 h后1 645 cm-1處吸收強度達到最大值 (圖 6)。對 CMP紅外譜圖進行溶劑峰差減、二階求導(dǎo)、去卷積和峰分辨擬合處理后結(jié)果顯示,CMP酰胺Ⅰ帶被擬合為 3個子峰,分別位于1 645 cm-1、1 630 cm-1和1 672 cm-1處 (圖 7)。

圖 7 CMP在重水溶液中的紅外實驗譜圖 (點)與紅外擬合譜圖 (粗線為疊加譜,虛線為分峰譜)

討 論

生物體內(nèi)組成蛋白質(zhì)的 20種氨基酸,除最簡單的甘氨酸不具有手性外,其余都是 L型,加之肽鍵的不對稱性,蛋白質(zhì)分子具有手性,也具有光學(xué)活性,其 CD光譜中在紫外區(qū)段有特征峰,可用于解析蛋白質(zhì)分子或多肽序列主鏈的構(gòu)象[4]。膠原蛋白的Rpn值通常被用來確定膠原蛋白的溶液構(gòu)象,正負峰強度比值變化在一定程度上能夠反映膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的變化[5]。由于 Rpn值能夠反映整個遠紫外區(qū)正、負兩峰的變化情況,比單獨依靠正峰強度變化能夠更真實地反映多肽鏈在熱變性過程當(dāng)中發(fā)生的構(gòu)象變化,并且實驗證明 Rpn值-溫度曲線與CD值-溫度曲線重疊良好,因此利用 Rpn值-溫度曲線表示多肽鏈熱變性過程所反映的三螺旋結(jié)構(gòu)變化信息應(yīng)當(dāng)更為全面。

由 CMP的 CD譜和 FTIR譜分析可知,在適當(dāng)溫度下 CMP可發(fā)生 “單體-三螺旋”結(jié)構(gòu)的可逆變化。CMP在水溶液當(dāng)中能組裝為高度有序的三螺旋結(jié)構(gòu)[6-7],并且其構(gòu)象具有溫度依賴性,高溫處理后的CMP能夠在適當(dāng)條件下實現(xiàn)結(jié)構(gòu)的可逆恢復(fù)。

氫鍵對于穩(wěn)定膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)具有重要作用,其中膠原蛋白肽鏈間的主要氫鍵作用力為 Gly-X-Y中 Gly酰胺基上的 H與相鄰另一條肽鏈 Gly-X-Y中 X上的羰基之間的氫鍵,膠原蛋白受溫度誘導(dǎo)的變性常伴隨著氫鍵的斷裂和三螺旋結(jié)構(gòu)喪失。然而由于膠原大分子氨基酸組成種類較多,氫鍵作用力關(guān)系復(fù)雜,不利于闡述 “結(jié)構(gòu)-作用力”的相關(guān)機制,本研究以合成的膠原模擬多肽 CMP為膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的模型分子,通過 FTIR研究其熱變性過程并分析穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)氫鍵作用力的相關(guān)信息,這對于研究膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)受溫度影響的相關(guān)機理具有重要指導(dǎo)作用。

羰基參與穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵作用,酰胺Ⅰ帶是三類羰基綜合作用的結(jié)果,每個羰基的紅外吸收變化都會引起酰胺Ⅰ帶的峰型變化[8-9]。酰胺Ⅰ帶吸收譜型的改變與羰基伸縮振動情況的變化有關(guān),由于序列中 3種氨基酸的羰基所處溶液環(huán)境不同,而氫鍵作用力對羰基伸縮振動影響較大,反映在紅外譜圖中應(yīng)當(dāng)具有不同的紅外吸收譜型。針對這種情況,本研究對 CMP紅外譜圖進行了溶劑峰差減、二階求導(dǎo)、去卷積和峰分辨擬合處理,結(jié)果顯示CMP酰胺Ⅰ帶被擬合為 3個子峰,分別位于1 645 cm-1、1 630 cm-1和 1 672 cm-1處 , 并分別代表 Pro、Gly和 Hyp的羰基吸收情況[10],由于 Pro羰基對1 645 cm-1的紅外吸收貢獻最大,Pro對應(yīng)的鏈內(nèi)氫鍵作用力的變化情況反映在紅外譜圖上為1 645 cm-1處的吸收強度變化。

Doyle等[11]研究認為,三股螺旋之間通過氫鍵穩(wěn)定,其中最重要的氫鍵是 Pro的羰基與另一條鏈上Gly的氨基之間形成的 (CPOP…NGHG),CPOP…NGHG是參與形成三股螺旋內(nèi)氫鍵,Gly和 Hyp的羰基都朝向三股螺旋的外部,與溶液的水分子形成氫鍵 (分別為 CGOG…HwOw和 CYOY…HwOw)。由于1 645 cm-1處的紅外吸收對應(yīng) Pro羰基的伸縮振動情況,而 Pro主要參與鏈內(nèi)氫鍵作用,因此,隨著溫度升高,1 645 cm-1處的吸收強度大幅度減少,顯示Pro羰基子峰的吸收強度降低,CPOP…NGHG的數(shù)量減少,鏈內(nèi)氫鍵逐漸解離,發(fā)生三螺旋向單體的轉(zhuǎn)變[12]。Gly和 Hyp主要參與 CMP水分子之間氫鍵作用,因此1 630 cm-1和1 672 cm-1處吸收強度隨著溫度升高,降低幅度不大,說明三螺旋結(jié)構(gòu)的改變對于 CGOG…HwOw和 CYOY…HwOw的影響不是很大。以上分析表明,Pro的羰基與異鏈 Gly的氨基之間形成的 (CPOP…NGHG)是穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的主要作用力,利用紅外光譜能夠有效分析 CMP三螺旋結(jié)構(gòu)熱變性過程的結(jié)構(gòu)變化信息,并且與 CD相比能夠更確切地反映穩(wěn)定肽鏈構(gòu)象氫鍵作用力的變化情況。

[1] Parry DA.The molecular and fibrillar structure of collagen and its relationship to the mechanical properties of connec-tive tissue[J].Biophys Chem,1988,29(1-2):195-209.

[2] Holmgren SK,Bretscher LE,Taylor K M,et al.A hyperstable collagen mimic[J].Chem Biol,1999,6(2):63-70.

[3] Koide T.Designed triple-helical peptides as tools for collagen biochemistry and matrix engineering[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2007,362(1484):1281-1291.

[4] Sreerama N,Woody RW.Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra:comparison of CONTI N,SELCON,and CDSSTR methodswith an expanded reference set[J].AnalBiochem,2000,287(2):252-260.

[5] Usha R,Ramasami T.Structure and conformation of intramolecularly cross-linked collagen[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2005,41(1):21-24.

[6] Kar K,Amin P,BryanMA,et al.Self-association of collagen triple-helix peptides into higher order structures[J].J Biol Chem,2006,281(44):33283-33290.

[7] Persikov AV,Ramshaw JA,Brodsky B.Prediction of collagen stability from amino acid sequence[J].J Biol Chem,2005,280(19):19343-19349.

[8] George A,Veis A.FTIRS in H2O demonstrates that collagen monomers undergo a conformational transition prior to thermal self-assembly in vitro[J].Biochemistry,1991,30(9):2372-2377.

[9] Bryan MA,Brauner JW,Anderle G,et al.FTIR studies of collagen model peptides:complementary experimental and simulation approaches to conformation and unfolding[J].J Am Chem Soc,2007,129(25):7877-7884.

[10] Lazarev YA,GrishkovskyBA,Khromova TB.Amide Iband of IR spectrum and structure of collagen and related polypeptides[J].Biopolymers,1985,24(8):1449-1478.

[11] Doyle BB,Bendit EG,Blout ER.Infrared spectroscopy of collagen and collagen-like polypeptides[J].Biopolymers,1975,14(5):937-957.

[12] Payne KJ,VeisA.Fourier transform IR spectroscopy of collagen and gelatin solutions:deconvolution of the amide I band for conformational studies[J].Biopolymers,1988,27(11):1749-1760.

張其清 電話:022-87890868,電子郵件:zhangqiq@126.com

Q518.4

A

1000-503X(2010)03-0343-04

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目 (973計劃)(2006CB933300)

2009-05-11)

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