蜂膠揮發油提取及其DPPH自由基清除率的研究

蔣金龍 王姝硯 繆曉青

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蜂膠揮發油提取及其DPPH自由基清除率的研究

蔣金龍 王姝硯 繆曉青*

福建農林大學蜂療研究所

蜂膠（propolis）是蜜蜂用從植物的嫩芽及樹干上采集的樹脂并混入自身上顎腺分泌物和蜂蠟混合而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物[1]。蜂膠成分極為復雜，主要由55%的樹脂樹香復合物、30%的蜂蠟、10%的芳香揮發油和5%的花粉及其它物質混合組成的[2]。蜂膠中的揮發油雖然含量較少，但也是一類非常重要的活性成分，具有獨特的芳香氣味和一定的生物學功能及藥理學作用[3]。Melliou等[4](2007)報道了五種希臘蜂膠的揮發性成分具有良好的抗細菌和真菌的功效。

目前蜂膠精油的提取方法常見的有：水蒸汽蒸餾法，固相微萃取法，溶劑提取法，超聲波輔助萃取，微波爐輔助萃取及超臨界CO2萃取等[5]。由于固相微萃取法及超臨界萃取成本比較高，而溶劑提取法和水蒸汽蒸餾法提取率較低，故本文采用超聲和微波這兩種普及率高且成本低的輔助技術來提取蜂膠揮發油。許多植物揮發油易溶于石油醚等極性小的有機溶劑中，也能溶于高濃度乙醇所以，本文研究主要采用石油醚，己烷，乙醚三種溶劑來提取蜂膠中的揮發油，并對其提取工藝和抗氧化能力進行比較研究。

1 材料與儀器

材料：蜂膠（原膠）由福建神蜂技術開發有限公司提供；DPPH產自于日本和光純藥工業株式會社，乙醇、石油醚、乙醚、己烷等均為分析純試劑。

儀器：旋轉蒸發儀RE52C5-2，上海亞榮生化儀器廠；微波爐MM823ESJ-PA(輸出功率為800W)，廣東美的微波爐制造有限公司；超聲波清洗器KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平BS223S，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；可見分光光度計WFJ 7200，尤尼柯（上海）儀器有限公司；等。

2 實驗方法

2.1 原料制備

蜂原膠置于-18℃環境條件下冷凍12小時，經粉碎機粉碎成100目以上的粉末后，按料液體積比為1：4加入90%乙醇，在40℃條件下超聲回流攪拌提取3次，時間為4h，過濾除雜后合并濾液，放入4℃條件下靜置12小時，讓其自然析出蜂蠟，過濾后真空抽濾得到精蜂膠。得率為40.2%。

2.2 蜂膠揮發油超聲波提取

取蜂膠（精膠）20克，加入5mL無水乙醇進行完全溶解，再分別加入溶劑石油醚、己烷，料液比為1﹕20，提取兩次，過濾后用溶劑洗滌殘渣，合并濾液后置于冰箱冷凍4個小時以上，待其析出蜂蠟后再過濾，如此反復冷凍過濾直到無蠟質析出為止。濾液在45℃旋轉減壓蒸發濃縮脫溶得到揮發油；另取毛膠50克，直接加入400mL的無水乙醇，其它步驟同上述條件。稱其重量計算得率，每溶劑平行三次實驗，取其平均值。

2.3 微波－超聲波萃取正交試驗

根據單因素試驗所得的的結果，以料液比、微波功率、超聲波萃取時間、超聲波萃取溫度為試驗因素，進行L9（34）正交試驗。

表1 蜂膠揮發油提取L9（34）因素水平表

2.4 蜂膠揮發油抗氧化性能的測定

2.4.1揮發油溶液與DPPH乙醇溶液的配制

揮發油的配制：準確稱0.050g揮發油，用無水乙醇定容到置于100 mL的容量瓶中，得濃度為0.5mg/mL的蜂膠揮發油樣液，再將其配制成0.5、0.05、0.01、0.005mg/mL系列濃度，精制蜂膠與BHT同法配制成相同系列濃度作為參考。

自由基的配制：精密稱取DPPH自由基 0.2561g，無水乙醇溶解 ,并定容1000mL ,搖勻得濃度為 256.1mg/LDPPH儲備液，冷藏備用 ,使用前用無水乙醇稀釋至濃度為 25.61 mg/L。

2.4.2揮發油自由基清除能力的測定

采用 DPPH自由基清除能力來評價抗氧化活性[6,7]。從容量瓶中吸取濃度為0.5mg/mL揮發油2mL置于試管中，再取DPPH乙醇溶液2mL并用無水乙醇定容5 mL均勻混合，室溫避光1h后采用分光光度法在517nm下測定其吸光度。以自由基的清除率作為抗氧化能力指標，每一吸光度平行3次測定，依照下式計算清除率：

式中 A0：2mL試樣空白溶劑+加入2mLDPPH乙醇溶液的吸光度；A1：2mL樣品溶液溶劑+加入2mLDPPH乙醇溶液的吸光度。

3 結果與分析

3.1 不同溶劑揮發油超聲波提取

石油醚、己烷、乙醚三種溶劑在相同條件下提取蜂膠揮發油的平均得率分別為：10.09%，8.95%，7.76%，石油醚的提取率是最高的。

3.2 微波－超聲波輔助提取揮發油的正交試驗

表2 微波－超聲波輔助提取揮發油正交實驗結果

從表2的結果和極差分析可以看出，各因素對提取蜂膠率大小的影響由大到小依次為A>C>B>D，即料液比 >超聲波提取溫度>微波功率大小>超聲提取時間，結合表中的提取率大小綜合考慮，蜂膠揮發油提取率最好的一組是 A2B2C2D1，即料液比為1∶20，提取溫度40℃，微波功率選擇中檔（輸出功率為800W），提取時間15min。

3.3 蜂膠揮發油清除DPPH的測定

表3 不同溶劑揮發油提取物的DPPH自由基清除效果

表3為蜂膠醇提物、3種揮發油和BHT在不同濃度時清除DPPH自由基的清除效果，圖1為樣品濃度0.005mg/mL～5mg/mL時，揮發油試樣濃度與DPPH清除率之間的關系；圖2為蜂膠揮發油及對照樣品在0.5和0.01mg／mL時不同清除率的比較結果。

圖1 DPPH清除活性與樣品濃度關系曲線

圖2 揮發油、蜂膠醇提物及BHT在濃度5mg/mL，0.01mg/mL時的抗氧化活性

結果表明，相對BHT抗氧化活性而言，蜂膠乙醇提取物具有很高的自由基清除能力，而三種蜂膠揮發油都具有一定的清除DPPH自由基的抗氧化活性，其中石油醚提取物的抗氧化活性最高，乙醚的相對最低。從圖1可以看出，不同溶劑提取的蜂膠揮發油樣品隨著濃度的增大，提高抗氧化性的增強的幅度不一。其中石油醚提取物和乙醚提取物表現出明顯的量效關系；在濃度大于0.05mg/mL時，石油醚提取物，蜂膠乙醇提取物和BHT抗氧化效果極為相似；五個試樣在溶液中的濃度大于0.5mg/mL時，其抗氧化活性蜂膠醇提物>BHT>石油醚提取物>己烷醚提取物>乙醚提取物：在5mg/mL時，石油醚提取物的抗氧化活性為82.2％，從圖1中可以直接讀出清除率為50％時的濃度IC50約為30g/mL。從圖2可以看出，在0.5mg/mL和0.01mg/mL時，抗氧化活性蜂膠醇提物>BHT>石油醚提取物>己烷醚提取物>乙醚提取物，三種蜂膠揮發油對DPPH自由基的清除率有較大的差別，表明為具有中強等抗氧化活性，清除率為10.87％～87.91％。

4 討論

采用了石油醚、乙醚、己烷作為溶劑，通過超聲波法提取蜂膠揮發性成分，并用正交試驗設計法優化石油醚提取揮發油工藝，得出最佳提取工藝參數。但沒有在充分利用試驗結果信息的基礎上，用回歸分析的方法，對均值和極差分析對其進行和修正，使工藝參數更符合實際情況。

本文對三種溶劑提取的揮發油和精制蜂膠和BHT的抗氧化效果作了比較研究，發現三種揮發油均有一定的抗氧化效果。為蜂膠產品開發提供依據，將來還需要對其抗氧化機理及成分進行分析。

[1] 付中民,鄭艷萍,楊文超,繆曉青.蜂膠提取工藝的研究[J].中國蜂業,2008,59(10):26

[2] 王亞群,任永新.蜂膠的化學成分及其保健作用[J].食品與藥品,2006,8(12):75-76.

[3] Rudzkie,Grzywaz.Dermatitis from propoLis[J].contact Dermatitis,1983,9:40-45

[4] E MeLLiou, E Stratis, I Chinou1.VoLatiLe constituents of propoLis from vari ous regi ons of Greece - Anti micr obiaL activity[J] Food Chemistry, 2007, 103 (2) : 375～380

[5] 趙強.蜂膠中揮發油有效成分的研究[D].南昌:南昌大學碩士學位論文,2007.

[6] 趙愛云,杭瑚.部分植物抗氧化活性的初步研究[J].天然產物研究與開發,1999 (3) :12-13.

[7] 方開泰. 均勻設計與均勻設計表[M].北京：科學出版社,1994.

繆曉青，福建農林大學蜂學學院院長，教授/博導。