米曲霉產脂肪酶的發酵條件優化

鄧琳芬 鄭 毅 王 婭 劉源慧

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米曲霉產脂肪酶的發酵條件優化

鄧琳芬 鄭 毅 王 婭 劉源慧

福建師范大學生命科學學院

對米曲霉產脂肪酶的發酵培養基進行優化。首先通過單因素試驗確定發酵最適碳源為玉米粉，最適氮源為蛋白胨，然后通過Plackett-Burman優化選出對發酵影響最顯著的因素，分別為蛋白胨、橄欖油、Na2HPO4。產脂肪酶的最適培養條件為：玉米粉0.5%，蛋白胨5%，橄欖油1.5%，NaNO31%，Na2HPO40.25%，KCl 0.05%，MgSO40.05%，FeSO40.001%。

米曲霉 脂肪酶 發酵條件

脂肪酶廣泛應用于脂肪的生產工藝、去污劑和脫脂業、食品、工藝、精細化學品合成業、造紙業、化妝品制造業以及制藥業中，脂肪酶還可用于油脂垃圾和聚氨酯的快速降解，大多數工業生產的微生物脂肪酶是出自真菌和細菌的酶[1]。隨著對脂肪酶研究的日益深入,其應用領域正日漸拓寬,與此相應,新型脂肪酶的研究開發就備受關注。通過對原有脂肪酶改性或對菌株進行優化培養可以得到新型的脂肪酶[2]。本研究對一株米曲霉產脂肪酶的發酵條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

米曲霉，為本實驗室保藏菌種。

1.1.2培養基

斜面培養基：0.2%NaNO3，0.1%Na2HPO4，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4,3%蔗糖,1.5%~2.0%瓊脂,1%麩皮.

種子培養基：0.5%玉米粉，0.5%葡萄糖，2%黃豆餅粉，0.5%酵母膏，1%NaNO3，0.1%Na2HPO4，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4。

初始設計發酵培養基：1%玉米粉，4%黃豆餅粉，1%橄欖油，1%NaNO3，Na2HPO40.1%，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4。

1.2 方法

1.2.1發酵培養

將菌種由斜面接種到40mL（250mL的三角瓶）的種子培養基中，30℃，230 r/min 的培養24h 制成液體菌種，然后按10％的接種量接入到40 mL（250 mL的三角瓶）發酵培養基中，在30℃，230 r/ min下進行發酵培養。

1.2.2 酶活測定方法

采用橄欖油底物乳化法[3]。加入5mL乳化橄欖油（4%PVA∶橄欖油=2∶1）及4mL0.05M的磷酸緩沖液（pH=7.5）于100mL小燒杯中，在37 ℃水浴鍋中預熱5min ，加入1 mL 酶液,反應10 min ，加入15 mL濃度95 %乙醇，滴加3d酚酞，用0. 05 mol/ L NaOH 溶液滴定，記錄消耗的堿量V1 。空白液先加乙醇，再加酶液，其余操作相同，此時消耗的堿量為V0。在此條件下，1min生成1μmol的脂肪酸定義為1個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 碳源的選擇

改變初始設計培養基中的碳源，分別以1％的玉米粉、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、果糖、玉米淀粉、麥芽糖、甘露醇、糊精作為碳源，研究不同碳源對產酶的影響。結果表明（圖1）：不同碳源對產酶影響較大，以蔗糖、葡萄糖、乳糖相對較好，玉米淀粉和甘露醇為碳源時產酶量最低，而以玉米粉為碳源時產酶量最高。玉米粉為最佳碳源，這與如王小花報道的蔗糖是最佳碳源的研究結果不同[2]。

圖1 不同碳源對產酶的影響

2.2 氮源的選擇

氮源分為無機氮源（硫酸銨、硝酸銨、尿素等）、有機氮源（如大豆粉、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白等）和復合氮源。一般認為復合氮源對微生物生長及產酶效果較好[4]。有機氮源一般比無機氮源要好, 如蛋白胨和酵母膏在細菌脂肪酶的生產中應用十分廣泛[5]。以1％的玉米粉為碳源，分別選用4％的黃豆餅粉、蛋白胨、酵母粉、1％的NaN03、NH4NO3作為氮源, 研究不同氮源對產酶的影響。試驗表明（圖2）：有機氮源為蛋白胨和酵母膏時，產酶量最高而且相當，選擇蛋白胨為有機氮源，無機氮源為硝酸鈉時產酶水平最佳。

圖2 氮源對產酶的影響

2.3 Plackett-Burman實驗設計篩選重要因子

采用Plackett-Burman實驗設計對培養基配方各組分（包括玉米粉，蛋白胨，橄欖油，NaNO3，Na2HPO4，KCl，MgSO4，FeSO4）進行重要性篩選，確定對產酶影響顯著的因素。選擇N=12的8因素2水平的Plackett-Burman試驗設計，進行培養基優化。以發酵培養基配方的不同組分作為優化輸入因子，輸入因子A-K分別代表玉米粉，蛋白胨，橄欖油，NaNO3，Na2HPO4，KCl，MgSO4，FeSO4，其中輸入因子C、F、I為估計誤差設置的虛擬項，每項均取高（+1）低（-1）兩水平，見表1，響應值Y為脂肪酶的酶活力，表中每列代表每種因素的不同水平。

表1 N=12的Plackett-Burman試驗設計方案及試驗響應值

Plackett-Burman試驗的二水平分析目的：在其它因素不變的情況下，分析某因素的變化對響應的影響，從而得出影響培養基組成的主效應因素，結果見表2。結果表明：培養基成分橄欖油, 蛋白胨以及Na2HPO4可信度均大于85%，為顯著因子，顯著性排序為橄欖油＞蛋白胨＞Na2HPO4。

表2 Plackett-Burman試驗設計因素水平及顯著性

3 培養基顯著因子單因素優化

3.1 蛋白胨對產酶影響

對培養基中蛋白胨的濃度進行優化，結果（如圖3），由圖可知，在濃度由1%到5%之間，酶活隨濃度的升高而升高，在蛋白胨濃度為5%達到最高值，再升高濃度酶活基本保持不變。以蛋白胨濃度為5%最佳。

圖3 蛋白胨濃度對產酶的影響

3.2 橄欖油對產酶影響

對培養基中橄欖油的濃度進行優化，結果（如圖4），由圖可知，濃度由0.25%到1.5%，酶活隨濃度升高而升高，1.5%時酶活達到最大，隨后酶活隨濃度升高反而降低。以橄欖油濃度為1.5%最佳。在試驗中，添加適量的橄欖油能夠提高產酶，說明發酵產的脂肪酶是誘導型脂肪酶。

圖4 橄欖油濃度對產酶的影響

3.3 Na2HPO4對產酶影響

對培養基中Na2HPO4的濃度進行優化，結果（如圖5），由圖可知，酶活隨濃度升高而升高，當濃度為0.25%時酶活最大，隨后，隨濃度升高酶活有所下降。以Na2HPO40.25%濃度為最佳。

圖5 Na2HPO4濃度對產酶的影響

4 結論

4.1 單因素優化結果表明，玉米粉為最佳碳源，蛋白胨為最佳有機氮源，NaNO3為無機氮源。

4.2 通過Plackett-Burman實驗從發酵培養基的8個組分中，篩選出對產酶影響最顯著的3個因素，分別是橄欖油、蛋白胨、Na2HPO4。

4.3 對培養基影響產酶3個組分進行單因素優化，結果表明：蛋白胨濃度為5%，橄欖油濃度為1.5%，Na2HPO4濃度為0.25%，產酶水平最高。

[1] 王小芬,等.微生物脂肪酶的研究進展[J].科技導報,2006,24,(2):10-12.

[2] 王小花,洪楓,朱利民,陸大年.米曲霉產胞外脂肪酶培養條件的優化[J].食品與發酵工業,2005,31(4):25-27.

[3] 鄔敏辰.堿性脂肪酶提取的探討[J].江蘇食品與發酵,1995,(4):4-8.

[4] 陶文沂,等.脂肪酶產生地酶7203菌株的分離和強度[J].微生物學報,1990,30(3):216-222.

[5] 彭立風.微生物脂肪酶的研究進展[J].生物技術通報,1999,(2):17-22.