光損傷視網膜片培養上清液誘導大鼠骨髓間充質干細胞為視網膜樣細胞的研究

白 月 徐國興 陳金國 謝茂松 郭 健 王婷婷

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光損傷視網膜片培養上清液誘導大鼠骨髓間充質干細胞為視網膜樣細胞的研究

白 月 徐國興 陳金國 謝茂松 郭 健 王婷婷

福建醫科大學附屬第一醫院,福建省眼科研究所

目的：探討大鼠視網膜片光損傷后誘導體外培養的大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)成視網膜細胞的可能性。方法：實驗研究。采用貼壁篩選法分離、培養SD大鼠骨髓MSC細胞，經流式細胞儀鑒定后，用大鼠視網膜片光損傷后的上清液與10%FBS的LG-DMEM以2:3混合成的條件培養液誘導MSC細胞7~8d。用免疫細胞化學染色和RT-PCR觀察誘導后的細胞是否表達視紫紅質、GFAP、NSE。結果：第3代MSC細胞經誘導后有（36.64±7.84)%表達rhodopsin, (20.21±6.47)%表達GFAP, (21.83±2.98)%表達NSE。RT-PCR鑒定結果分析示GFAP、NSE、Rhodopsin mRNA均有表達。結論：光損傷SD大鼠視網膜片培養上清液可誘導MSCs分化為視網膜樣細胞。

骨髓間充質干細胞 視網膜細胞 大鼠

成體干細胞中的骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）具有多向分化的潛能，雖然其來源于中胚層，卻可以跨胚層分化為外胚層來源的組織細胞，而視網膜則來源于胚胎期神經外胚層。MSC表達許多生長因子和細胞因子受體以及細胞與細胞黏附作用的受體，提示MSC的功能受自分泌和旁分泌循環的調控。這成為不同方法誘導MSCs定向分化的理論基礎。組織或細胞在受到損傷后會進行自身修復，視網膜是接受光能，形成視覺的重要組織結構，如果光照強度或光照時間超過了視網膜的承受力，將會造成視網膜光損傷。本研究旨在用光損傷視網膜片的培養上清液體外誘導MSCs，看其損傷時分泌的細胞因子和分化所需蛋白是否能誘導MSCs分化為視網膜光感受器樣細胞和視網膜神經細胞。探索體外構建MSCs分化成視網膜細胞所需微環境的理論可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康無眼病成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，體重120~150g（吳氏實驗動物中心）。

1.2 大鼠視網膜片的取材

10%水合氯醛按0.3mL/100g腹腔注射麻醉，無菌狀態下取出眼球。把眼球用10%FBS的LG-DMEM洗滌3次，去除球周筋膜組織，清洗干凈后移入另一盛有10% FBS的LG-DMEM培養皿中，在解剖顯微鏡下，在角鞏膜緣后1mm處剪開，用顯微剪取出角膜、晶狀體、玻璃體，留有外層覆蓋鞏膜的視網膜杯。把視網膜杯浸入培養皿中的培養液里，由杯緣向杯底，用顯微鑷鈍性分離視網膜和鞏膜，在視神經處剪斷，徹底分離視網膜色素上皮層與視網膜神經上皮層。

1.3 大鼠視網膜神經上皮層常規石蠟切片HE染色

將大鼠視網膜片（只包含神經上皮層）常溫浸泡甲醛24h以固定，常規脫水、透明、包埋、切片，常規脫蠟，行蘇木素-伊紅(HE)染色，封片。用數字攝像系統觀察并采集照片。

1.4 視網膜片光損傷和條件培養液的制備

把分離好的4只眼球的視網膜神經上皮層移入另一盛有8mlNeurobasal+B27的小培養皿中（直徑60mm）。用眼科顯微剪把視網膜神經上皮層剪成1mm×1mm×1mm大小。在超凈臺內，50W,12V的鹵素燈作為光源，采取直落式照射上述的小培養皿，用TES-1330A照度計測定光照強度，調整光源與培養皿之間的距離（3.5cm），使被照細胞同一水平的光照強度為(1950 ±200)Lux ,光照時該水平溫度變化在0.5℃之內，持續光照45min，光照后將培養皿放入37℃、5%CO2飽和濕度培養箱繼續培養1小時15min。用去針頭的針筒吸出小培養皿中的液體，離心后上清液用0.22um濾器過濾，以2:3的比例與10%FBS-LGDMEM混合，并吹打均勻，制成條件培養液Ⅰ。條件培養液Ⅱ制備方法同條件培養液Ⅰ，只是視網膜片未經過光損傷處理，盛有Neurobasal+B27和視網膜神經上皮層的小培養皿直接放入37℃、5%CO2飽和濕度培養箱培養2小時。條件培養液Ⅲ為Neurobasal+B27和10%FBS-LGDMEM以2：3的比例混合，無視網膜片以及光損傷處理。三種條件培養液均放于-20℃保存。

1.5 視網膜神經上皮層光損傷后電鏡觀察

取材，3%戊二醛—1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸—1.5%亞鐵氰化鉀后固定，酒精—丙酮脫水，環氧樹脂618包埋劑包埋；超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，日立Hu-12A型（飛利浦208型）透射電鏡觀察、攝影。

1.6 大鼠MSC的分離和培養

取SD大鼠，麻醉后，無菌條件下取出雙側股骨和脛骨，剔除周圍肌肉組織。在超凈臺內，用PBS沖干凈，轉移到盛有20%FBS-LGDMEM的培養皿中，去除長骨2端骨骺，暴露骨髓腔。用培養液沖出骨髓腔內的骨髓液，吹打。用200目篩網過濾后置于離心管中，1000rpm,10min，棄上清，用10%FBS-LGDMEM培養液重懸后以10×108/mL接種于塑料培養瓶中。37℃、5%二氧化碳培養，24h換液，以后每3d換液一次，除去非貼壁細胞，12~15d后MSC達90%瓶底面積時傳代，P1后細胞融合至80%進行1：2傳代。

1.7 MSC的鑒定

當第3代的BMSCs融合達90%,經0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化、離心后用PBS制成2×106/mL的細胞懸液，將細胞懸液分裝至4只樣品管中，分別加入熒光標記的小鼠抗大鼠單抗CD34-FITC+小鼠抗大鼠單抗CD90-PE，小鼠抗大鼠單抗CD34-FITC+小鼠抗大鼠單抗CD44-PE及其對應的同型對照各10μL，混勻，37℃下避光反應20min。每管加入1mLPBS混勻，離心2000rpm，10min以洗去未標記上的抗體。棄上清液，每管再加入1mLPBS重新混懸細胞,用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD44和CD90的表達。對細胞純度進行鑒定。

1.8 MSC體外誘導成視網膜細胞

取第3代BMSCs細胞消化、離心后用10%FBS-LGDMEM重懸后以200ul/孔接種于6孔板，24h待BMSC貼壁后，棄培養液，將細胞分為3組：第1組換用條件培養液Ⅰ，第2組換用條件培養液Ⅱ，第三組換用條件培養液Ⅲ，3個組均在在37℃、5%CO2培養箱孵育。每天觀察記錄細胞生長分化情況，每2天換一次條件培養液，培養至第7~8天時停止。

1.9 誘導的BMSCs細胞免疫化學染色

采用Envision二步法，分別將3組誘導的MSC玻片取出，均與神經元特異性標志小鼠抗大鼠醇化酶(NSE)（稀釋度1：50）（美國Fisher Scientific公司）、星形膠質細胞特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體神經膠質酸性蛋白(GFAP)（稀釋度1：50）（美國Fisher Scientific公司）、光感受器特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體視紫質(Rhodopsin)（稀釋度1：50）（美國Fisher Scientific公司）和二抗（生物素標記的羊抗鼠IgG抗體）作用，二氨基聯苯胺（diaminobenzidin,DAB）顯色后，蘇木素復染，室溫干燥后封片，光鏡下觀察是否表達視紫紅質、NSE、GFAP。選取至少10個隨機視野，每個視野在200倍物鏡下統計陽性細胞數和整個視野細胞總數，計算陽性細胞率，測量值均以x±s表示，來對三種誘導條件下所表達的陽性細胞進行分析。

1.10 數據分析方法

所有數據用均數±標準差表示，并進行雙因素方差分析。

2 結果

2.1 大鼠視網膜片光損傷電鏡觀察所見:光損傷后視網膜神經上皮層，可見光感受器外段腫脹成圓形，盤膜結構紊亂，疊狀結構解離，膜間隙增大。內節線粒體固縮和腫脹，空泡變性。染色質濃染，核膜皺縮內陷。

2.2 大鼠MSC細胞的鑒定(如圖1)

圖1 大鼠MSC細胞的鑒定

BMSCs流式細胞術鑒定結果，培養的第三代BMSCs干細胞表面標志CD90陽性（CD90+/CD34-：92%），基質細胞表面標志CD44陽性（CD44+/CD34-：93%）

2.3 誘導分化的細胞形態學觀察（如圖2）

A：3天后原來梭形的BMSCs胞體發生收縮，呈圓形或橢圓形，細胞邊緣變得不規整，有零星的細胞突起×300；B：4天后BMSCs有較多突起×300；

2.4 誘導分化的視網膜樣細胞不同誘導條件下免疫細胞化學染色表達指標陽性率

表1 不同誘導條件下免疫細胞化學染色表達指標陽性率

注：均方比F值為7.6054，F0.05=6.944，可見視網膜片三組間兩兩比較差異有顯著性（P ＜0.05）。

3 討論

3.1 視網膜光損傷

視網膜是接受光能，形成視覺的重要組織結構，但也是眼組織中最易受到光損傷的部位。如果光照強度或光照時間超過了視網膜的承受能力，將會造成視網膜光損傷。

本實驗采用（50W,12V的鹵素燈作為光源，采取直落式照射上述的小培養皿，1950 ±200Lux）主要是考慮到以下幾點：①視網膜光損傷受諸多因素影響，內在因素包括視網膜部位、體溫、膚色、年齡、種屬、營養狀態及晶體狀況，外在因素包括視網膜暗適應狀態、光照射方式、光強度、波長和光照時間。因此本實驗選擇單純照射細胞而不是照射活體動物來盡量排除內在因素的干擾，選擇成年SD白鼠是考慮到有研究表明白種人較黑種人容易損傷，大白鼠視網膜對光的敏感性隨著年齡的增加而增高。②視網膜光化學損傷的敏感性隨著光波長的縮短而呈對數上升，因此短波長更易引起視網膜光損傷，角膜可吸收<295nm的紫外線，晶體可吸收波長<400nm，而且短波長的近紫外光引起的視網膜損傷主要位于色素上皮層，而我們取的SD大鼠視網膜片只有神經上皮層，所以不考慮用紫外光進行光損傷。紅外光波長大于可見光，造成視網膜損傷不僅有光化學損傷還有熱損傷，并且以損傷視網膜色素細胞為主，而光化學損傷在視網膜光損傷中最具普遍性和重要性，可見光造成視網膜光損傷屬于光化學損傷，而且可見光為隨處可見光源，并可到達人眼視網膜，因此最終考慮用鹵素燈作為光損傷光源。③光對視網膜損傷有3種方式：熱損傷、機械損傷、光化學損傷。要注意避免光照時溫度的升高，因為溫度升高可以增加視網膜光損傷的易感性，溫度每升高2℃，視網膜損傷閾較正常體溫降低5~10倍，要使溫度變化在10℃以內以排除溫度升高引起細胞光熱損傷的可能[1]。④照射時間相同時，照射強度增加，損傷加重。光照強度相同條件下，光照時間越長，損傷越重。Semple-Rowland提出65~130lux為損傷的閾值，宋憶淑等將裝有RPE細胞的6孔培養板放在光照器下，鹵鎢燈為光源，(1950±200)Lx的光照強度，持續光照30min，光照結束后．繼續培養。分別于光照結束后30 min及2 h對培養的RPE細胞進行倒置相差顯微鏡觀察。同時采集培養的RPE細胞，進行透射電鏡觀察根據預實驗電鏡結果，隨著光照后培養時間的延長，細胞出現損害的程度逐漸加重，受損的細胞數目逐漸增多[2]。

3.2 MSC細胞分離、培養、鑒定

用組織工程技術體外分離和培養所需靶細胞，用于體內相關疾病的細胞替代治療為多種疾病帶來了新的治療思路。因此有關此類的研究受到廣泛關注。胚胎干細胞具有發育全能性，但涉及倫理學問題，以往受到很大限制，發展緩慢。應用眼色素上皮緣的視網膜干細胞[3]及鼠腦神經先祖細胞移植[4]也由于供體組織有限性及安全性問題，不利于治療視網膜疾病的開展。于是有人把目光投向成體干細胞中的MSCs，因其來源于中胚層，可以跨系統甚至跨胚層分化為3個胚層來源的細胞，特別是中胚層和神經外胚層來源組織的細胞（視網膜來源于胚胎期神經外胚層），并且經過20~30次細胞分裂后，這種分化特性也不會消失[5]。且分離培養方便。MSC存在于體內多處如胎血、胎肝、胎脾、胎兒的骨髓以及成人骨髓[6], 臍血、脂肪組織和成人的外周血中亦含有數量極少的間質干細胞[7]，現多從骨髓中分離獲得。MSC的純化方法有貼壁篩選法，流式細胞儀分選法，密度梯度離心法，免疫磁珠法。較常采用的方法為貼壁篩選法和密度梯度離心法，或兩者聯合。MSCs的表面標志具有非單一性，表達了間質細胞、內皮細胞和表皮細胞的表面標志，一般認為CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD120a、CD124、CD166以及STRO-1、SH2、SH3是其重要的標志物，流式細胞術發現不表達造血細胞表面抗原如CD34、CD45、CD11a、CD14。如果能找到更特異性標記物，就可以獲得更純的MSCs，這對后續的實驗步驟所得的實驗數據有重要影響。前2種方法分離所獲得的細胞純度較低,但具有良好的細胞分化能力。應用流式細胞儀技術和磁性分選技術針對細胞表面標志進行富集和分離,分選效率和純度均較高[8-9]。

3.3 MSC體外誘導成視網膜細胞

目前國內外主要用生長因子誘導MSCs分化為視網膜細胞。Anthony K等[8]發現EGF、taurine或activinA體外誘導大鼠MSCs，有20%~32%表達視網膜光感受器細胞的表面抗原視紫紅質。Anthony K等[8]應用activinA（活化蛋白A），?；撬岷虴GF對成人CD90+MSCs體外誘導分化后，20%-32%的細胞表達感光細胞特異標志—視紫紅質，視蛋白，recoverin。非視網膜來源的，可替代視網膜細胞功能的自體細胞是細胞移植治療視網膜變性疾病和視神經損傷的理想種子細胞，目前國外有少量研究發現MSCs視網膜下移植可誘導分化為視網膜細胞，但由于體內局部微環境復雜，影響因素繁多，移植細胞的分化方向不確定，往往無法定向分化成所需細胞，存在表達增殖性玻璃體視網膜病變的潛在危險。而體外誘導MSCs定向分化為視網膜細胞仍是當前研究的難點。國內外僅數篇文獻報道用視網膜片培養上清液體外誘導MSCs分化為視網膜樣細胞，但均未對培養上清液成分進行具體分析檢測，分析其有效成分。本實驗探索體外誘導MSCs定向分化的新途徑，可進一步進行蛋白質組學技術檢測不同誘導微環境的蛋白差異，為構建MSC體外誘導分化為視網膜細胞的微環境提供理論支持。這不僅解決了直接將MSCs體內移植分化方向不確定的問題，以及應用異體的人視網膜片誘導時可能引發排斥反應等問題。

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1.福建省重點科研課題(基金編號2008Y0040)；2.國家衛生部科研基金課題(基金編號:WKJ2008Y004-2-61)。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。