CTGF反義寡核苷酸對體外培養人晶狀體上皮細胞轉分化的影響

莊 華 徐國興 白 月 謝茂松 郭 健 王婷婷 胡建章

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CTGF反義寡核苷酸對體外培養人晶狀體上皮細胞轉分化的影響

莊 華 徐國興 白 月 謝茂松 郭 健 王婷婷 胡建章

福建醫科大學附屬第一醫院,福建省眼科研究所

目的：研究結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)反義寡核苷酸對體外培養人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells, HLECs)合成CTGF與а-SMA表達的影響。方法：測算CTGF反義寡核苷酸對體外培養HLECs的轉染率；應用CTGF反義寡核苷酸直接轉染第三代HLECs進行細胞生長曲線的測定；采用RT-PCR檢測細胞CTGF和α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA) mRNA水平。結果：直接導入法反義寡核苷酸進入較慢，但導入72h后未出現細胞毒性。CTGF反義寡核苷酸直接導入HLECs培養細胞72h后可見對細胞增殖的抑制作用。直接導入法處理48h后，TGF-β1能顯著增加CTGF以及α-SMA mRNA的表達，但卻可被CTGF反義寡核苷酸所抑制。而錯義寡核苷酸卻沒有這種作用。結論：CTGF反義寡核苷酸直接轉染HLECs能抑制TGF-β1誘導的CTGF與α-SMA表達上調，提示CTGF反義寡核苷酸可能為防治后發性白內障提供新途徑。

結締組織生長因子 晶狀體上皮細胞 反義寡核苷酸

后發障又稱為后囊膜混濁（posterior capsule opacification, PCO），是白內障術后最常見的并發癥，亦是白內障術后視力下降的主要原因。白內障術后殘留的HLECs在囊膜上轉分化、增生、移行，產生膠原，是發生后囊膜混濁的主要原因。這些轉分化的HLECs產生大量的細胞外基質（extracellular matrixc, ECM），ECM是構成纖維化混濁的重要成分，導致了纖維化斑塊的形成，最終導致后發性白內障。在此過程中，殘留的LECs表達α-SMA。α-SMA正常表達于平滑肌與心肌，晶狀體中出現α-SMA為后發障的標志，因此，α-SMA可作為HLECs轉分化的指標。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β, TGF-β1）能促進HLECs發生纖維化。TGF-β1除了致纖維化作用外，尚有抗增殖，抗炎等重要功能，長期抑制TGF-β1的活性將對機體產生不利影響。TGF-β1下游的效應因子作為治療的靶點將更具有實用價值。CTGF作為TGF-β1的下游因子，特異地受TGF-β1誘導表達，介導了TGF-β1部分的促纖維化效應。CTGF誘導HLECs轉分化為肌成纖維細胞，并表達а-SMA。轉分化的LECs可分泌大量細胞外基質，進而導致囊下混濁的發生。

反義寡核苷酸技術是近年來出現的一種根據堿基互補原理，通過抑制mRNA的轉運、成熟和翻譯、誘導特異性核酸酶產生等機制對特定的靶基因表達產生阻滯，從而抑制或封閉異常或高表達的基因，使其喪失活性，達到基因調控的目的。本研究通過體外細胞實驗，CTGF反義寡核苷酸干預細胞生長，初步探討CTGF在白內障發生中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑

逆轉錄試劑盒（美國Fermentas公司），Trizol Reagent（美國Fermentas公司），Taq PCR MasterMIX（美國Fermentas公司），PCR引物（上海英駿生物技術有限公司），人重組轉化生長因子β1（TGF-β1）（美國Pepro Tech INC公司），陽離子脂質體轉染劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），CTGF反義寡核苷酸和錯義寡核苷酸（上海英駿生物技術有限公司），CCK-8試劑盒（碧云天生物技術公司），HLECs來自HLEC-B3細胞株（美國ATCC細胞庫）

1.1.2引物及寡核苷酸序列

1.1.2.1 PCR引物

根據Pubmed上各因子mRNA全長序列由Invitrogen Biotechnology公司設計、合成（上海英駿生物技術有限公司），序列如下：

CTGF：上游5’- AAATCTCCAAGCCTATCAAG -3’；下游5’- TTCATGCCATGTCTCCGTACA-3’；擴增cDNA片段長度為270bp。

α-SMA：上游5’- AGGTAACGAGTCAGAGCTTTGGC-3’；下游5’- CTCTCTGTCCACCTTCCAGCAG-3’；擴增cDNA片段長度為199bp。

β-actin：上游5’-GCATCCTGACCCTGAAGTACC-3’；下游5’- GCTCATAGCTCTTCTCCAGGG -3’；擴增cDNA片段長度為523bp。

1.1.2.2 寡核苷酸序列

CTGF反義寡核苷酸（antisence oligonucletide, ASON）和錯義寡核苷酸（scrambled oligonucletide, SC）：

根據人CTGFmRNA的全長序列和文獻由上海英駿生物技術有限公司合成，全部硫代磷酸化修飾，寡核苷酸還進行5’-異硫氰酸熒光素(5’-FITC)標記，序列如下：CTGF反義寡核苷酸(AS)：5’-TACTGGCGGCGGTCAT-3’全部硫代磷酸化修飾，部分5’-FITC標記；CTGF錯義寡核苷酸(SC)：5’-GGTCTAGCTTGCGGAC-3’全部硫代磷酸化修飾。

1.2 方法

1.2.1反義寡核苷酸的導入：將HLECs按1×105/mL的密度接種于6孔板，用含5% FCS的DMEM/HIGH GLUCOSE培養，待細胞亞融合時，改為含2% BSA的培養液培養24h。（1）脂質體包裹法：將4μg的反義寡核苷酸與10μL的脂質體混合，室溫放置15 min后加入到培養液中，作用3h、6h。（按Lipofectamine2000使用說明書進行操作）。（2）直接導入法：將4μg反義寡核苷酸直接加入培養液中混勻，作用24h，48h，72h。上述兩法的細胞液避光。用無血清DMEM/高糖洗細胞數次，熒光顯微鏡觀察FITC綠色熒光，隨機選擇20個視野計算陽性細胞數，以同一視野下熒光顯微鏡與光鏡觀察到的細胞數之比計算導入率。（3）反義寡核苷酸以30μg/mL的濃度直接導入HLECs中，測定反義寡核苷酸導入48h后的導入率。

1.2.2 CCK-8比色實驗檢測反義寡核苷酸直接導入法對體外培養的HLECs增殖活力的影響

細胞以每孔5000個細胞的密度接種于96孔板，細胞貼壁后實驗組加入含濃度為30μg/ml無5’-FITC標記反義寡核苷酸的、含8%FCS的DMEM/高糖培養基，分別培養24h、48h、72h后，吸去培養液，每孔加100μL的8%FCS的DMEM/高糖培養基以及10μL的CCK-8溶液，37℃細胞培養箱孵育2h，酶標儀測450nm光吸收值。

1.2.3 RT-PCR檢測CTGF反義寡核苷酸對體外培養的HLECs CTGF及α-SMA基因表達的影響

將體外培養的第三代HLECs按2×105/mL的密度接種于25cm2培養瓶，用含10%胎牛血清的DMEM/高糖培養基培養，待細胞80%融合時，改為無血清DMEM/高糖培養基培養24h，使細胞達到同步。

分組：(1)正常對照組(C組)：用DMEM/高糖培養基培養，作用48h；(2)TGF-β1組(T組)：用含TGF-β110ng/mL DMEM/高糖培養基培養，作用48h；(3)反義寡核苷酸組(T+AS組)：用含TGF-β110ng/mL和30μg/mL反義寡核苷酸的DMEM/高糖培養基培養，作用48h；(4)錯義寡核苷酸組(T+SC組)：用含TGF-β110ng/mL和30μg/mL SC的DMEM/高糖培養基培養，作用48h。

RT-PCR(兩步法)：PBS洗滌各組細胞，在培養瓶中加入TRIzol RNA提取液，按說明書步驟提取總RNA，按RT-PCR試劑盒操作，總反應體積為20μL。CTGF反應參數：94℃預變性5min，擴增94℃ 30s，53℃ 45s，72℃ 45s，30個循環，最終延伸72℃ 7min。α-SMA反應參數：94℃預變性5min，擴增94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 45s，30個循環，最終延伸72℃ 7min。β-actin反應參數：94℃預變性5min，擴增94℃ 30s，59℃ 45s，72℃ 45s，30個循環，最終延伸72℃ 7min。取PCR產物，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統成像，用圖像分析處理系統（美國BIO-RAD公司）進行灰度掃描，以灰度值代表其表達量。用β-actin的量校正，將二者灰度值的相對量進行分析。

2 結果

2.1 Lipofectamine-反義寡核苷酸復合物的導入效率的檢測結果

脂質體導入法6h見此時細胞變圓，貼壁不良，顯示出脂質體的毒性作用。脂質體導入法3h，6h導入細胞陽性率分別為41%，85%。脂質體導入6h，可以顯著增加反義寡核苷酸的導入（P<0.05），但已對細胞有毒性作用。

2.2 反義寡核苷酸直接導入法效率的檢測

直接導入法24h的導入率較低，為23%，表現為多數細胞僅僅細胞膜染色。48h和72h組導入率增加，分別為63%和66%，后兩者之間無顯著性差異(P>0.05)。直接導入法培養72h后，細胞形態正常，未見明顯毒性作用。30μg/mL反義寡核苷酸48h轉染率達75%。

2.3 CCK-8比色實驗檢測反義寡核苷酸直接導入法對體外培養的HLECs增殖活力的影響

SPSS軟件統計分析：24h組對照組與實驗組無顯著性差異（P>0.05）；48h組對照組與實驗組無顯著性差異（P>0.05）；72h組對照組與實驗組有顯著性差異（P<0.05），實驗組細胞增殖受明顯抑制；見表1。

表1 反義寡核苷酸對HLECs增殖活力的影響

2.4 RT- PCR檢測CTGF反義寡核苷酸對體外培養的HLECs CTGF及α-SMA mRNA表達的影響

CTGF反義寡核苷酸作用48h，可以大部分抑制CTGFmRNA與α-SMAmRNA的表達，而錯義寡核苷酸不能抑制CTGFmRNA與α-SMAmRNA的表達（圖1、圖2，表2、表3）。

圖1 CTGF mRNA在HLECs的表達

表2 不同處理組HLECs CTGF mRNA的表達情況（%,± s）

注：與FSM組比較：*P＜0.05；與T+AS組比較：#P＜0.05；與T組比較：◆P＞0.05。

圖2 α-SMA mRNA在HLECs的表達

表3 不同處理組HLECs α-SMA的表達情況（%,± s）

注：與FSM組比較：*P＜0.05；與T+AS比較：#P＜0.05；與T組比較：◆P＞0.05。

3 討論

后囊膜混濁是當前白內障摘除術后影響視力恢復的最主要并發癥之一[1-2]，其發生率一般在術后5年成人為50%，嬰幼兒可達100%。目前后發障的治療包括藥物治療和手術治療。藥物可使用多種抗代謝藥物如：秋水仙堿、裂霉素C(MMC)、5-Fu、柔紅霉素等，抗代謝藥能明顯抑制LECs生長，但由于這些藥物缺乏細胞特異性，對周圍組織毒性較大，給臨床使用帶來不便。隨著反義寡核苷酸進入PCO治療研究領域中，國內學者劉宏偉、李長福等分別進行了bFGF和bcl-2的反義寡核苷酸對HLECs增殖活性的影響研究。Kampmeier等利用反轉錄病毒載體將反義細胞周期蛋白G1與反義MAT1分別轉染體外培養的人胚胎HLECs，通過特異性下調細胞周期蛋白G1與MAT1的表達來抑制細胞的增殖活性，并觀察到細胞停滯于G1期，而且凋亡細胞的數目有顯著性增加，提示反義基因治療防治PCO可能是一種新的有效的治療方法。

在RT-PCR實驗中，我們用10ng/mL TGF-β1直接轉染48h可引起CTGF mRNA、α-SMA mRNA表達顯著升高，說明TGF-β1可以顯著誘導CTGF和α-SMA mRNA的表達。但是這種誘導作用在反義寡核苷酸組中，被30μg/ml的CTGF反義寡核苷酸所阻斷，表明反義寡核苷酸可以在mRNA水平上阻斷TGF-β1對CTGF與α-SMA表達的誘導作用[3]；在錯義寡核苷酸組中，CTGF mRNA、α-SMA mRNA的表達水平與TGF-β1組無顯著性差異(P>0.05)。實驗結果說明CTGF反義寡核苷酸特異地抑制了TGF-β1促HLECs轉分化的作用。TGF-β1刺激細胞轉分化通過了CTGF途徑，CTGF介導了TGF-β1誘導的α-SMA合成，是TGF-β1的部分生物學功能的下游調節因子。

在對HLECs進行體外實驗時，我們發現脂質體短時間就可以提高HLECs的轉染率，然而培養6h后出現了細胞毒性反應，細胞貼壁不良，形態變圓，少數細胞已死亡并漂浮于培養基中。直接轉染法24h轉染率偏低；然而48h轉染已可接近高峰，63%細胞的細胞質內可見細小熒光顆粒。CCK-8測定反義寡核苷酸（30μg/mL）對細胞生長的影響可發現24h組和48h組對照組與實驗組并無顯著性差異(P>0.05)，提示反義寡核苷酸（30μg/mL）小于48h的轉染對細胞生長并無太大影響；72h對照組與實驗組有顯著性差異(P<0.05)說明在轉染達72h后，該濃度的反義寡核苷酸開始抑制HLECs的增殖。

通過體外實驗，我們證實了CTGF反義寡核苷酸在抑制HLECs增殖的作用和抑制TGF-β1的轉分化作用。由于CTGF生物學效應相對單一，主要介導促細胞增生和ECM合成以及組織纖維化作用[4]。CTGF反義寡核苷酸可能為防治后發性白內障提供新途徑。

[1] 徐國興.眼科學基礎[M].北京:高等教育出版社,2005:1-210.

[2] Meacock WR, Spalton DJ, Stanford MR. Role of cytokines in the pathogenesis of posterior capsule opacification[J]. Br J Ophthalmol, 2000,(84): 332-336.

[3] Guo Haike. Effect of TGF-β1on proliferation of rabbit lens epithelial cells and expression of connective tissue growth factor[J]. Chin Ophthal Res, 2006,(24): 5-8.

[4] Abou-Shady M, Friess H, Zimmermann A, et al. Connective tissue growth factor in human liver fibrosis[J]. Liver, 2000, 20 (4): 296-304.

1.國家自然科學基金重點項目（基金編號：60827002）；2.福建醫科大學教授發展基金課題（基金編號：2006-js6033）。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。