人骨髓間充質干細胞誘導分化為RPE樣細胞的探討

侯澤江 徐 巍 郭 健 徐國興

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人骨髓間充質干細胞誘導分化為RPE樣細胞的探討

侯澤江 徐 巍 郭 健 徐國興

福建醫科大學附屬第一醫院，福建省眼科研究所

目的：探索骨髓間充質干細胞(BMSCs)體外定向分化成視網膜色素上皮（RPE）樣細胞所需的微環境。方法：采用淋巴細胞分離液梯度離心法分離純化BMSCs，第一階段將培養第3代的細胞以bFGF、EGF及BDNF三種因子首先進行向神經前體細胞誘導分化，應用免疫細胞化學檢測誘導細胞巢蛋白表達情況，當巢蛋白陽性表達率達到最高時去除誘導因子，進行第二階段與第三代人RPE細胞共培養誘導2w，兩階段誘導后均采用免疫細胞化學及RT-PCR方法檢測角蛋白及RPE65蛋白表達情況。結果：免疫細胞化學檢測方面，誘導第3d開始能檢測到巢蛋白表達，第12d陽性表達率達到最高，達（86.9±2.6)%，第一階段誘導后見角蛋白表達，未見RPE65蛋白表達，第二階段誘導后見角蛋白表達，陽性率為（60.8±3.1)%，見RPE65蛋白表達，陽性率為（25.7±3.8)%。RT-PCR檢測方面，兩階段角蛋白與RPE65蛋白結果與免疫細胞化學檢測結果一致。結論：體外采用分階段誘導法，應用因子bFGF、EGF、BDNF及與RPE細胞共培養的微環境作用下能在體外誘導BMSCs表達RPE細胞標志物角蛋白以及RPE65蛋白。

骨髓間充質干細胞 分化 視網膜色素上皮細胞 共培養

視網膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium，RPE）細胞組織學上來源于神經外胚層，具有重要的生理功能，但是視網膜色素上皮細胞無再生能力，因而，當其功能障礙時會導致嚴重的遺傳性、變性性視網膜病變，如視網膜色素變性等，目前通過藥物和手術均不能阻止其進展、惡化。通過視網膜干細胞途徑達到視網膜再生是一條希望之路，但是哺乳類動物視網膜干細胞成年后則很少具有活性，因此，外源性視網膜細胞移植可能是一個有希望的途徑。

可直接應用于移植的視網膜干細胞非常有限，組織工程學的興起為外源性視網膜干細胞的產生帶來了新的希望，骨髓間充質干細胞（BMSCs）是至今研究最值得關注的成體干細胞，骨髓間充質干細胞是來源于中胚層的多能成體干細胞，大量的實驗證實體外不同的微環境對BMSCs具有不同的誘導分化效果。BMSCs不僅能向中胚層的成骨細胞等分化，而且能跨胚層分化，如向內胚層的肝細胞樣細胞以及外胚層的神經干細胞樣細胞等分化。本實驗探索誘導BMSCs向視網膜色素上皮細胞定向分化的微環境,現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM-LG培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（Hyclone, USA）；bFGF、EGF、BDNF、PEDF(Peprotech,USA)； Taurine（Sigma,USA）；淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；小鼠抗人巢蛋白單克隆抗體、小鼠抗人角蛋白8＆18單克隆抗體、小鼠抗人RPE65單克隆抗體（NeoMarkers，USA）；流式細胞術試劑小鼠抗人單抗CD34-FITC+小鼠抗人CD90-PE，小鼠抗人單抗CD34-FITC+小鼠抗人CD44-PE（Beckman-Coulter，USA）, RT-PCR試劑盒（Fermentas，USA），transwell雙層共培養系統（Corning，USA）。

1.2 方法

1.2.1骨髓的采集、BMSCs 的分離與培養

骨髓取自健康成年捐贈者，實驗符合國務院1994年頒布的《醫療機構管理條例》第33條原則。抽取骨髓約5mL，將骨髓用PBS稀釋后以1000rpm離心5min，洗滌2次，將下層血漿用等量DMEM-LG培養基重懸后采用淋巴細胞分離液（相對密度為1.077kg/L）密度梯度離心分離，輕輕吸取白色霧狀單核細胞層，置于離心管中再次用PBS洗滌2遍，用含10%FBS的DMEM-LG培養基吹打分散后調整細胞密度為1×106/mL接種于25cm2塑料培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。72h后予以首次換液，以后每3d換液1次。

1.2.2 BMSCs的形態學觀察與細胞表面抗原的流式細胞儀檢測

倒置相差顯微鏡下觀察原代及傳代細胞形態學變化及增殖情況，并拍照記錄。按照謝茂松等[1]對骨髓間充質干細胞的流式細胞術鑒定方法步驟進行，第3代人BMSCs 90%融合時用胰蛋白酶消化，用流式細胞儀檢測BMSCs CD34（造血干細胞表面抗原），CD44（基質細胞表面抗原）及CD90（干細胞表面抗原）的表達情況。

1.2.3 RPE細胞的采集、分離與培養

RPE細胞取自福建醫科大學附屬第一醫院眼科角膜移植術后的供體眼球，具體操作方法按照徐國興等[2]提出的步驟進行，無菌條件下行眼杯消化法消化RPE層，將消化液中和后離心，用含15%胎牛血清的DMEM/F12培養基重懸接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。72小時后開始首次半量換液，以后每3天換液一次，當細胞貼壁密度達80%時消化傳代。

1.2.4 RPE細胞的免疫細胞化學檢測鑒定

RPE65蛋白檢測：收集細胞爬片進行RPE65蛋白的免疫細胞化學檢測：PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，5%正常羊血清封閉，加入小鼠抗人RPE65蛋白單克隆抗體（稀釋度為1：100），4℃過夜，滴加聚合物輔助劑及生物素化山羊抗小鼠IgG， DAB顯色及蘇木素復染，自來水洗滌后干燥，樹脂封片，顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.5誘導分化

實驗分兩組：誘導組和對照組。誘導組分兩階段誘導：首先向神經前體細胞誘導分化，再進一步與RPE細胞共培養向RPE細胞專向誘導分化。取第3代人BMSCs按 5×104/mL密度接種六孔板中，培養基為含10% FBS的DMEM-LG，每個六孔板中預先放蓋玻片進行爬片，24h后將培養基更換為含20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF及 20ng/mLBDNF進行第一階段誘導，在因子誘導的2d開始進行巢蛋白的檢測，檢測到巢蛋白表達率最高時進行第二階段誘導，采用transwell雙層非接觸共培養體系，將第一階段誘導的BMSCs接種于transwell下層并爬片，取第三代RPE細胞接種于transwell上層，進行共培養誘導并觀察細胞形態變化，對照組采用含10% FBS的DMEM-LG培養基培養，不加任何干預。

第二階段向RPE樣細胞方向誘導后角蛋白及RPE65蛋白表達的免疫細胞化學檢測,角蛋白8＆18及RPE65蛋白抗體稀釋度均為1:100。

1.2.6共培養誘導前及共培養2w后采用RT-PCR方法檢測角蛋白及RPE65蛋白表達情況

第二階段誘導前和誘導2w后，收集細胞，Trizol裂解細胞提總RNA，取1μlRNA在逆轉錄酶作用下合成cDNA，然后以此cDNA為模板，以角蛋白引物序列：上游5'-GAGGCATCCAGAACGAGAAGG-3'下游5'-CGGGCATTG TCCACAGTATTTG-3'（擴增片段長223bp），RPE65蛋白引物序列:上游：5'-TTCAACCTCTTCCATCACATCAAC-3'下游：5'-GATTCAAGCCAAGTCCATACGC-3'（擴增片段長397bp），內對照β-肌動蛋白（β-Actin）引物序列：上游：5'-AAAGACCTGTACGCCAACACAG-3'下游：5'-TTTTAGG ATGGCAAGGGACTTC-3'（擴增片段長度：556bp）（由南京金斯瑞生物公司設計并合成）擴增。產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統拍照。

2 結果

2.1 BMSC形態及鑒定結果

原代培養48h有部分細胞貼壁，少數形態呈桿狀，4~6d細胞呈桿狀或梭形，形成多個不同大小的細胞集落，7~10d呈放射狀向外擴展，細胞呈梭形，并逐漸融合成漩渦狀單層細胞。傳代后細胞分布均勻，形態一致，長梭形，呈成纖維細胞樣形態（見圖1）。

第3代人BMSCs表面抗原檢測顯示CD90表達陽性率CD90+/CD34-：96.3%，CD44表達陽性率CD44+/CD34-：94.2%，表明所獲得的細胞絕大部分為BMSCs。

2.2 RPE細胞鑒定：RPE65蛋白免疫細胞化學檢測結果

第三代RPE細胞呈梭形，融合時可呈多邊形，鏡下可見胞漿內少量色素顆粒，隨著傳代的延續色素顆粒逐漸減少。

圖2 第三代RPE細胞融合（×100）

圖3 免疫細胞化學檢測RPE細胞的RPE65蛋白表達情況（免疫細胞化學二步法，DAB染色，蘇木素復染，×100）

2.3 誘導第一階段誘導的BMSCs巢蛋白免疫細胞化學檢測結果

誘導第3d開始能檢測到巢蛋白表達，第12d陽性表達率達到最高，達（86.9±2.6)%。

圖4 免疫細胞化學檢測誘導BMSCs巢蛋白表達情況（免疫細胞化學二步法，DAB染色，蘇木素復染，×100）

2.4 誘導第一、二階段后細胞角蛋白及RPE65蛋白的免疫細胞化學檢測結果

第一階段誘導后可檢測到角蛋白表達，但未見RPE65蛋白表達；第二階段誘導后檢測到角蛋白陽性率為（60.8±3.1)%，RPE65蛋白表達陽性率為（25.7±3.8)%；

圖5 免疫細胞化學檢測誘導BMSCs角蛋白表達情況（免疫細胞化學二步法，DAB染色，蘇木素復染，×100）

圖6 免疫細胞化學檢測誘導BMSCs后RPE65蛋白表達情況（免疫細胞化學二步法，DAB染色，蘇木素復染，×100）

2.5 誘導第一、二階段角蛋白及RPE65蛋白的RT-PCR檢測結果

實驗組第一階段誘導后RT-PCR檢測角蛋白及RPE65蛋白，發現有角蛋白表達，未見明顯RPE65蛋白表達；實驗組第二階段誘導后發現角蛋白及RPE65蛋白均有表達；對照組未見角蛋白及RPE65蛋白表達。

圖7 兩階段誘導角蛋白的RT-PCR 結果

圖8 兩階段誘導RPE65蛋白的RT-PCR 結果

3 討論

本實驗采用分階段誘導BMSCs向神經外胚層來源的視網膜色素上皮細胞方向分化。干細胞在體內分化與微環境密切相關，不同的發育階段干細胞所處的微環境不同將會影響干細胞發生不同的分化，干細胞進入新的微環境后,對新的微環境的調節信號做出反應，分化成與新的生長環境相適應的細胞。我們采用分階段誘導是在細胞分化的不同階段提供合適的微環境以期向特定細胞分化。第一階段采用神經細胞生長分化所必須的生長因子誘導BMSCs向神經前體細胞分化，第二階段將分化成的神經前體細胞與RPE細胞供培養，利用RPE細胞所分泌的相關物質來提供一個微環境，促使誘導的神經前體細胞向RPE樣細胞分化。

有實驗證實骨髓間充質細胞表面存在PDGF、FGF和EGF受體等。本實驗首先使用bFGF、EGF及BDNF三種因子進行誘導BMSCs向神經前體細胞誘導分化。這些因子具有以下的生物學功能：bFGF具有促有絲分裂功能，在神經元發生、分化和功能方面起著重要作用，在體外bFGF能提高視網膜表達視蛋白的水平，體內有神經視網膜保護作用。BDNF能延緩神經元的變性和自然死亡，對神經元的存活和生長具有重要作用，有很強的刺激和促進神經細胞生長、分化的功能；不僅能保護神經元的功能，而且能促進光損傷的視網膜修復；BDNF能明顯促進光感受器細胞生存；在發育中的RPE細胞中有BDNF表達。大量實驗證實EGF存在于視網膜，可能與胚胎發育期和生后的光感受器細胞的誘導分化有關，它是視網膜神經元有效的分化因子。

RPE細胞能分泌多種生長因子,這些因子是維持視網膜完整結構所必須的，RPE維持光感受器細胞的存活，RPE能分泌FGF（FGF-1, FGF-2, FGF-5），IGF-1,PEDF等。PEDF有神經保護和為抗血管生成功能，提供環境保護，健康眼RPE能分泌PEDF維持視網膜和脈絡膜結構，并支持光感受器細胞和神經視網膜細胞的生長[3]。RPE細胞已知的能分泌以上多種因子，還有分泌一些其他未知的營養成分，這些對于RPE細胞的生長是必需的，因此本實驗將誘導分化后的神經前體細胞再與RPE細胞共培養，利用RPE細胞分泌的各種因子為神經前體細胞提供一個微環境，以促進其向RPE樣細胞方向分化。

本實驗采用細胞角蛋白8＆18(CK8＆18)與RPE65蛋白鑒定誘導分化后的細胞。細胞角蛋白是細胞骨架蛋白的一種，見于所有的上皮細胞，細胞角蛋白包括多個亞型，不同的上皮細胞表達不同亞型的細胞角蛋白。RPE細胞表達分子量為45KD的CK18和分子量52KD的CK8。而在視網膜組織，RPE細胞是視網膜中的上皮細胞，其它非上皮細胞不表達細胞角蛋白表面標志。RPE65 基因定位于1p31,編碼視網膜色素上皮特異蛋白, RPE65蛋白是RPE細胞特異性蛋白，故而在該組織中表明就是RPE細胞。本實驗第一階段檢測角蛋白即有表達，但未見RPE65蛋白表達；第二階段誘導分化后檢測細胞的角蛋白8＆18與RPE65蛋白，均有表達，表明所誘導的部分細胞具有合成角蛋白8＆18與RPE65蛋白的特征。

本實驗結果顯示在適當的微環境下可以誘導BMSCs分化為表達角蛋白及RPE65蛋白的細胞，但體外的誘導與體內的微環境有著很大的差別，體外誘導分化的細胞是否具有RPE細胞的生理功能如吞噬功能，有序排列，形成緊密連接等仍不明確，這些問題均需要更加深入的研究。

[1] 謝茂松,徐國興,李瓊等.大鼠骨髓間充質干細胞分離培養方法的比較[J].國際眼科雜志,2007,7（5）:1285-1287.

[2] 徐國興,楊娟,孫堂勝等.體外原代培養人視網膜色素上皮細胞[J].國際眼科雜志,2004,4（1）:12-15.

[3] Barnstable CJ, Tombran-Tink J. Neuroprotective and antian-giogenic actions of PEDF in the eye: molecular targets and therapeutic potential, Prog. Retin. Eye Res, 2004, 23:561–577.

1.福建省省重點科研課題（基金編號：2008Y0040）。 2.國家衛生部科研基金課題（基金編號：WKJ2008-2-61）。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。