使用漆酶/介體系統除去不同類型紙漿中的親脂性抽出物

使用漆酶/介體系統除去不同類型紙漿中的親脂性抽出物

所謂樹脂問題是指木材和其他的木素纖維素材料中的親脂性抽出物在制漿造紙過程中產生的不利沖擊。本文采用漆酶/介體系統進行樹脂的生物控制，并對漆酶催化處理的可行性進行評價。為了這一目的，我們以1-羥基苯并三唑作為氧化還原介體，采用從擔子菌類中的Pycnoporus硃紅菌素中提取出的高氧化還原電位的漆酶來處理三種不同類型的漿，三種漿分別代表三種不同的原材料制漿過程，它們是桉木硫酸鹽漿、云杉熱磨機械漿和亞麻蘇打-蒽醌漿，然后再用氣相色譜和氣相色譜-質譜聯用分析酶催化處理的漿中的親脂性抽出物，研究結果表明，漆酶/介體系統處理法可以完全或者大部分地除去樹脂引起的親脂性化合物存在于不同漿中的問題，它包括（1）桉紙漿中游離和共軛的谷甾醇；（2）云杉漿中的樹脂酸、甾醇酯和甘油三酯；（3）亞麻漿中的甾醇和脂肪醇。漿中甾醇的氧化過程中會發現有不同量的游離和共軛的7-氧甾醇作為中間產物生成。因此，用漆酶/介體系統處理闊葉木、針葉木和非木材植物的紙漿，被認為是一種去除樹脂產生的親脂性化合物的有效方法。

1 介紹

可從木素纖維素中抽出的非極性親脂性抽出物,在制漿造紙過程中會引起技術、經濟和環境問題，即通常所說的樹脂問題。在整個制漿造紙過程中，不同的親脂性抽出物可以導致樹脂問題，這取決于它們的化學性質以及使用的制漿方法。全無氯漂白的使用代替了原始的無元素氯漂白，更加重了樹脂問題，這是因為全無氯漂白試劑與親脂性抽出物有較低的反應活性。 樹脂沉積在紙漿中會導致漿和紙的質量下降，沉積在造紙設備中需要停車沖洗。

傳統上，樹脂沉積物可通過剝皮，原木和木片儲藏或加入物理化學試劑使其減少。然而，這樣的費用是很高的，而且這樣產生的效果往往不能夠令人滿意。作為替代物，用酶或微生物處理的生物技術除去抽出物的應用已被提出。然而，可用的商業制劑不是完全有效的，因為他們基于酶（脂肪酯）或主要水解的甘油三酯的微生物。除脂肪酶之外，甾醇酯酶也已被建議采用。然而,游離甾醇和甾醇酯一樣會產生問題。因此,解決由不易水解和生物降解的親脂性抽出物產生的樹脂問題的新方法仍然是需求的。

漆酶處理針葉木漿模型過程用水的研究結果表明，親脂性抽出物發生了改性。與脂肪酶和甾醇酶相比，漆酶是氧化酶，主要作用于酚型化合物。然而，漆酶/介體系統的使用增加了漆酶在木素降解和其他化合物中的電勢。盡管漆酶/介體系統處理在木素上的作用被認為是有選擇性的，但是它仍然一定程度地氧化了纖維素。然而，這種氧化被證明僅僅是部分可逆的 （處于還原態的可能恢復原來的黏度）。漆酶/介體系統作用于漿中木質和漂白方面已經有許多研究。然而，有關漆酶/介體系統對親脂性抽出物的最終作用的研究卻很少。在這篇文章中，研究漆酶/介體系統處理除去木材（包括闊葉木種和針葉木種）和非木材植物紙漿（包括機械和化學法處理）中的親脂性抽出物的適用性，使用的是從解木素的真菌Pycnoporus硃紅菌素中提取出的漆酶，它是一種人造氧化還原介體。

2 材料和方法

2.1 紙漿

桉木（Eucalyptus globulus)硫酸鹽漿取自西班牙Pontevedra ENCE造紙廠。未漂（褐色）桉木漿由硫酸鹽制漿經氧脫木素后取樣，卡伯值為14.2，ISO白度為41.2%。挪威云杉未漂熱磨機械漿（TMP）取自赫爾辛基 （芬蘭）UPMKymmene漿廠頭道磨漿，ISO白度為63%。經蘇達蒽醌蒸煮的未漂亞麻 (Linum usitatissimum)漿是由在Tortosa（西班牙）的CELESA廠提供，卡伯值為11，ISO白度為37%。

2.2 真菌漆酶和介體

處理漿料的漆酶由Beldem(Andenne,比利時)提供。它是從一種產漆酶很高的菌株Pycnoporus硃紅菌素中獲得的。漆酶活性通過在pH值為5，溫度為24°C， 濃度為0.1M的乙酸鈉中氧化5分鐘，2，2′-連氮基-雙 (3-乙基苯并噻唑基-6-酸性硫酸基酸)(ABTS， 取 自 Roche)為 陽 離 子 自 由 基 l(ε436 29，300 M-1cm-1) 來測定。 每分鐘轉化為 1 μmol，ABTS的量定義為一單位活性。1-羥基苯并三唑是從Sigma-Aldrich獲得的。

2.3 用漆酶/介體系統處理紙漿

200 g絕干漿，漿濃為10%，大氣壓為6kg/m3，漿處理在4L不銹鋼反應器中進行。云杉熱磨機械漿是在大氣壓下通入氧氣進行處理的，酶用量是20u/g漿。1-羥基苯并三唑用量是絕干漿重量的1.5%，pH值為4，溫度是50℃，時間為2小時。評價酶催化處理作用的其他平行實驗中的一組是條件相同但不加酶也不加介體。另外有一組處理中加酶不加介體，還有一組是只加介體。

2.4 漿和濾液中的親脂性抽出物

酶處理的紙漿和空白樣，經過濾后在40℃下干燥，分別用丙酮萃取8小時，用甲基叔丁基醚（MTBE）抽提處理液試樣，然后分析調查從漿中最終釋放出的脂質，所有的抽出物通過蒸發烘干重新溶解于氯仿中，用氣相色譜法和氣相色譜-質譜聯用來分析其中的親脂性抽出物，所有的丙酮和MTBE抽出物都是完全溶于氯仿的。這揭示了它們的親脂性質。雙三甲基硅、三氟化酰胺（取自supelco）以吡啶形式出現被用來為三甲基硅的衍生物作準備。

2.5 GC（氣相色譜）和GC/MS（氣相色譜一質譜聯用）分析親脂性抽出物

GC（氣相色譜）分析抽出物是用Agilent 6890N Network GC系統用一個短絲石英毛細柱 (DB-5HT，5 m ×0.25 mm I.D.，0.1-μm 鏡厚)來自于J&W研究科學所。溫度從100°C開始，保持一分鐘后以每分15℃的速度升至350℃，恒溫3分鐘。注射器和火焰離子化檢測器的溫度分別控制在300℃和350℃。所裝氣體是氦，噴速為5毫升/分鐘。注射器要密封無裂縫。峰值是通過GC色譜范圍測定的。標準化合物的混合物（包括十八烷、十六醇、棕櫚酸、脫氫樅酸、甾醇、7-氧膽甾醇、谷甾醇3-β-D-吡喃半乳糖苷、膽甾醇油酸鹽和三十七烷（triheptadecanoin）被用來制定親脂性抽出物定量的曲線。所有情況下相對系數都高于0.99。將兩個平行測定所得數據求平均值。所有情況下，兩次平行測定的標準偏差都低于平均值的10%。當有些峰值重疊（如云杉抽出物中的脂肪酸和樹脂酸），用單離子GC/MS色譜 （如下）連同GC分開這些整合。

GC/MS分析是用安裝了一個離子阱檢測器(Varian model Saturn 2000)的Varian模型星3400GC進行的。GC使用了一個如上所述相同的媒介長度(12 m)的毛細管柱。烘箱被以10°C/min的速度從120°C（恒溫 1min）加熱到 380°C（恒溫 5min）。 輸送管控制在300°C。噴射器以200°C/min的速度加熱，使溫度從 120°C（0.1min）到 380°C，恒溫直到分析結束。氦被用來做為運輸氣體，速度為2ml/min。化合物被鑒定出是通過與Wiley and NIST圖書館比較質譜得出的。其他比較包括碎片質譜法，及與標準值比較。

圖1化合物的化學結構代表了存在于紙漿中的主要植物酸種類，分析如下：棕櫚酸（a）；脫氫樅酸（b）；n-二十八（碳）醇（c）；菜油甾醇（d）；谷甾醇（e）；豆甾烷醇（f）；7-氧代谷甾醇（g）；豆甾-3，5-二胺-7-酮（h）；谷甾醇 3-β-D-吡喃半乳糖苷（i）；7-氧谷甾醇 3-β-D-吡喃半乳糖苷（j）；谷甾醇亞油酸鹽（k）；三亞油精（l）。

3 結果

三種未漂紙漿分別代表三種不同的木素纖維素材料：闊葉木（桉）、針葉木（云杉）和非木材（亞麻），也代表不同的制漿過程（硫酸鹽法制漿，熱磨機械漿和亞麻蘇打—蒽醌漿漿）這三種漿用從擔子菌類Pycnoporus硃紅菌素中提取出具高氧化還原電位的漆酶處理，其中加入氧化還原介體HBT。和同步平行實驗中未加酶的相比，用漆酶/介體系統處理不同的漿都會影響所有主要的脂類。相比之下，只用漆酶處理的漿中沒有發現脂類的改性。

3.1 用漆酶/介體系統處理桉木硫酸鹽漿

空白試樣和漆酶/介體系統催化處理的桉漿試樣中主要親脂性化合物含量如表1所示。以游離和共軛形式（苷和酯）存在的甾醇是主要的化合物。一些類固醇烴、類固醇酮（比如豆甾-3，5-二胺-7-酮和7-氧代谷甾醇）和一些游離脂肪酸被鑒別出。

表1 空白試樣和漆酶/介體系統催化處理桉漿中親脂性抽出物的組成（mg/kg漿）

表1告訴我們用漆酶/介體系統處理幾乎完全除去了桉漿游離甾醇、甾醇酯和谷甾醇3-β-D-吡喃葡萄糖。桉漿中80%以上以游離甾醇表現出來的谷甾醇被完全除去，只有少量的豆甾醇存在于處理后的漿中。另一方面，我們發現漆酶/介體系統處理后的漿中豆甾-3，5-二胺-7-酮、豆甾-3-酮，尤其是7-氧代谷甾醇的量有所增加。同時7-氧代谷甾醇（處理的漿中類固醇酮72%），我們也發現雙-不飽和酮（豆甾-3，5-二胺-7-酮）和苷（7-氧代谷甾醇和3-β-D-吡喃葡萄糖）的量顯著增加。

3.2 用漆酶/介體系統處理云杉TMP漿

空白試樣和漆酶/介體系統催化處理的云杉TMP漿試樣中主要親脂性化合物含量。如表2所示。在云杉熱磨機械漿中，親脂性抽出物的組成成分不同于桉漿云杉漿中存在很高含量的甘油三酯，甾醇酯和樹脂酸。除此之外，云杉漿中含有較少量的脂肪酸和游離甾醇（菜油甾醇和谷甾醇），還含有少量脂肪醇、類固醇酮和甾醇苷。

表2 空白試樣和漆酶/介體系統催化處理云杉漿系統中親脂性抽出物的組成（mg/kg漿）

表2說明，酶催化處理去除了大部分的甘油三酯、甾醇酯和甾醇苷。酶介體處理對樹脂酸和游離甾醇的去除效果明顯。以上一些脂類不能夠被漆酶/介體系統處理過程完全除去，這與云杉漿的處理條件（在大氣氧下進行）有關。最后，脂肪醇和脂肪酸與其它親脂性化合物相比被除去的程度很低。漆酶/介體系統處理后，氧化7－氧代菜油甾醇和7－氧化谷甾醇還有雙不飽和酮、麥角甾烷－3，5－二胺－7－酮和豆甾烷－3，5－二胺－7－酮增多，這種情況在酶催化處理桉漿時也會發生。雖然沒有單獨進行測量，但在處理的云杉漿中發現了7－氧代脫氫樅酸。

通過對同步試驗中只用酶處理的漿及所得液體的分析，證實了漆酶/介體系統處理云杉TMP除去親脂性抽出物的潛能。這些分析表明在沒有酶的控制體系中，漿中只有很小百分比（5%的谷甾醇，4%的甾醇酯和4%的甘油三酯）的脂類釋放到處理系統的液體中。然而，在酶處理過程中這些脂類就被降解了。在對桉和亞麻漿處理所得液體進行研究時，我們也得到同樣的結果，那就是處理后親脂性抽出物的含量減少了。

3.3 用漆酶/介體系統處理亞麻蘇打－蒽醌漿

空白試樣和漆酶/介體系統催化處理亞麻蘇打－蒽醌漿中主要親脂性化合物含量如表3所示。亞麻漿中脂類餾分的組成也與另外兩種漿不同。主要的化合物是從二十二烷醇到三十二烷醇的脂肪醇。鑒別出很大量的游離甾醇和甾醇苷，也有少量的類固醇酮和蠟類（脂肪酸類和脂肪醇類的酯）存在。

表3表明漆酶/介體系統處理完全除去了原來存在于亞麻漿中的三種甾醇（谷甾醇、菜油甾醇和豆甾烷醇），然而在處理漿中有一定量的氧化化合物（7-氧代谷甾醇、7-氧化菜油甾醇和7-氧代豆甾烷醇還有個別的雙-不飽和酮，麥角甾烷－3，5－二胺－7－酮和豆甾烷－3，5－二胺－7－酮）出現。 同時，三種原來的甾醇苷（甾醇，菜油甾醇和豆甾烷醇3-β-D-吡喃葡萄糖）也完全被除去，只有少量的7-氧代甾醇苷出現，脂肪醇和鏈烷烴也被很大程度的除去，雖然它們比漿中其它親脂性化合物對漆酶介體作用抵抗得更多。此外，沒有很好處理的峰值的混合物和工業過程中使用的消泡劑在酶處理過程中也被除去了。

表3 空白試樣和漆酶/介體系統催化處理亞麻漿中親脂性抽出物的組成（mg/kg漿）

4 討論

目前的研究表明漆酶/介體系統可以有效地除去不同來源的紙漿中存在的大多數脂類。這是相比較而言沒有預測到的結果，因為酶催化系統作用于頑固性植物脂類在此之前是沒有報道的。

漆酶/介體系統在除去甾醇 （減少95%～100%）方面是很有效的，也包括游離的谷甾醇、谷甾醇苷和脂肪酸酯，這些是桉木硫酸鹽漿中最典型的脂類。這些化合物在桉木的親脂性抽出物中存在，它們在蒸煮和氧前漂時仍存在，是制漿過程中樹脂問題的起源。在它們中，飽和的豆甾烷醇對漆酶介體系統作用的頑固性要大于不飽和谷甾醇。據報道，豆甾烷醇對氯二氧化物作用的抵抗很大。在處理過程中桉漿中的類固醇酮量的增加說明它們是類固醇的氧化產物，原始桉漿中已經存在的少量7-氧代谷甾醇是在制漿和氧氣去木質作用中形成的。氧衍生物存在的增加是與漆酶介體處理的氧化性質相合的，這是一個金屬酶催化的氧反應。

就云杉TMP漿而論，三種主要的脂類的樹脂問題（甘油三酯、樹脂酸和甾醇）在可變效率（65%～100%）內被除去。就桉漿而言，漆酶/介體系統除去了大部分甾醇，這在云杉漿中主要以脂肪酸酯狀態存在。類固醇酮的最后含量是低的，這表明它們的形成主要是在氧化酶攻擊游離甾醇的過程中。在兩種其它脂類針葉木和它們的機械漿中，甘油三酯通過漆酶/介體系統處理被影響的程度 （減少90%以上）高于樹脂酸（70%以上）。樹脂酸造成困難的原因在于它們對降解的抵抗性以及它們中一些所具有的高毒性。用漆酶單獨除去針葉木制漿白水中的脂類已有報道，但這種結果與漆酶/介體系統處理除去的較大的量相比是易變的。樹脂問題在非木材植物漿方面的資料少于在木材漿方面的資料，但是親脂性抽出物仍然是制漿過程中樹脂問題產生的原因，尤其當更多合理的措施被采用之前。漆酶/介體系統處理幾乎完全除去亞麻漿中的甾醇，它們主要以游離和糖基的形式存在，這正如前面討論的桉漿和云杉漿，而且漿中典型的重要百分比的醇也被除去。有趣的是大部分亞麻漿中被證實是包含在樹脂沉積物中的消泡劑在酶處理過程中也消失了。以氧化還原介體形式存在的Pycnoporus硃紅菌素，它在亞麻和桉漿中起著脫木素和漂白作用，它的有效性已有報道。在本文中我們證明可以使用漆酶/介體系統第一次同時除去有害脂類和木素。分析不同漿中存在的主要脂類，包括游離和共軛谷甾醇、甘油三酯、樹脂酸和脂肪醇都被很大程度地除去了 （有時是完全除去）。用漆酶-HBT除去樹脂導致幾種形式氧衍生物的形成，這些衍生物在原始漿中不存在或即使存在量也很少。盡管這樣，漿中脂類總含量也顯著減少，大部分造成困難的化合物也完全被除去了。不論及制漿過程，原材料或化合物降解的化學性質，指出漆酶/介體系統在去除漿中脂類的有效性是必要的。盡管酶催化處理系統除去制漿中的脂類和木素有很大的潛能，但在工業理論變為現實之前仍有許多的問題 （比如通過基因工程和其它方法減少漆酶介體的使用，尋找一種安全、價格低廉有效的酶介體）需要我們去解決。

劉海棠編譯自：Appl Microbiol Biotechnol(2006)vol.72 No.9:845–851

2010－4－10

論 著