利用制酒廢水產生生物絮凝劑MFHJ4的研究

王麗麗 王向東 田 哲 劉婉玉 葉永姣

(四川大學建筑與環(huán)境學院,四川成都,610065)

利用制酒廢水產生生物絮凝劑MFHJ4的研究

王麗麗 王向東 田 哲 劉婉玉 葉永姣

(四川大學建筑與環(huán)境學院,四川成都,610065)

以制酒廢水作為替代培養(yǎng)基對HJ4菌株進行培養(yǎng),考察了營養(yǎng)和環(huán)境條件對絮凝劑合成的影響,提取劑種類、提取劑加入量、上清液p H值等對絮凝劑提取效率的影響。結果表明,復合型生物絮凝劑MFHJ4的最佳合成條件為:COD濃度為12000mg/L,以硫酸銨為氮源,C∶N=20∶1,初始p H值為4.5,培養(yǎng)溫度為30℃,搖床轉速為150r/min,培養(yǎng)時間為24h;該絮凝劑的最佳提取條件為:HJ4菌株發(fā)酵培養(yǎng)24h后對離心上清液進行濃縮,在濃縮液中加入3倍體積無水乙醇進行提取,MFHJ4的產量為3.85g/L。

制酒廢水培養(yǎng)基 生物絮凝劑 提取方法 絮凝活性

微生物絮凝劑是由微生物產生的具有生物活性的大分子物質,具有良好的絮凝沉淀性能。近年來微生物絮凝劑因具有可生物降解且無二次污染等特點而受到廣泛關注[1,2]。但到目前為止,生物絮凝劑在實際生產中尚未得到推廣應用,生產成本過高一直成為阻礙其推廣的主要原因。

筆者利用廉價的制酒廢水培養(yǎng)基對 HJ4菌株進行發(fā)酵培養(yǎng),并對絮凝劑的研制條件進行優(yōu)化考察,如優(yōu)化培養(yǎng)條件、提取方法等,以降低生物絮凝劑的生產成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用水

制酒廢水:取自成都某酒廠,其水質參數:COD為 90525 mg/L,還原糖為 14200mg/L,總磷為648.4mg/L,總氮為1691.3mg/L,p H值為3.26。

印染廢水:取自成都市某印染廠,廢水顏色為藍灰色。水質參數:COD為857.5mg/L,p H值為7.5-8.5,色度為610倍,濁度為416.03度。

1.1.2 試驗用菌種及培養(yǎng)基

試驗用菌種:試驗所用的復合型絮凝劑產生菌HJ4為成都市某污水處理廠二沉池活性污泥中分離獲得兩株酵母菌混合而成,并由本實驗室保藏。

制酒廢水培養(yǎng)基:對制酒廢水按照不同的倍數稀釋,并依據C∶N∶P值添加營養(yǎng)物質,在121℃下高溫滅菌30min后備用。

1.1.3 高嶺土懸濁液

稱取1g高嶺土(160目)放入1 L水中,充分攪勻并靜置90 min后吸取上清液,該上清液即為所需的高嶺土懸濁液。

1.2 試驗方法

1.2.1 絮凝活性測定

于250mL燒杯中加入高嶺土懸濁液93 mL,1%CaCl2溶液5 mL,發(fā)酵液或 2.5g/L MFHJ4溶液2mL,用1mol/L的 NaOH溶液或 1mol/L的HCl溶液將p H值調至7.0左右。用電動攪拌器快攪(250r/min)30s,再慢攪(70r/min)5min,靜置15min后,吸取上清液于550 nm處測定其吸光度(B),以加蒸餾水的樣品作對照,550 nm處測定吸光度(A)。絮凝活性計算式如下:

絮凝率(%)=(A-B)/A×100%

1.2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

(1)COD濃度對絮凝效果的影響:分別將廢水培養(yǎng)液的 COD濃度調至 6000、9000、12000、15000mg/L,在氮源為硫酸銨、C∶N∶P值為100∶5∶1的條件下連續(xù)培養(yǎng)36h,取樣測其絮凝活性。

(2)外加氮源種類對絮凝效果的影響:分別采用氯化銨、硝酸銨、尿素、硫酸銨作為外加氮源,在廢水培養(yǎng)液COD濃度為12000mg/L,C∶N∶P值為100∶5∶1的條件下連續(xù)培養(yǎng)36h,取樣測其絮凝活性。

(3)C∶N值對絮凝效果的影響:分別將廢水培養(yǎng)液的 C∶N 值調至5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1,在廢水培養(yǎng)液的 COD濃度為12000mg/L,氮源為硫酸銨的條件下連續(xù)培養(yǎng)36h,取樣測其絮凝活性。

(4)p H值對絮凝效果的影響:分別將廢水培養(yǎng)液的 p H 值調至 3、3.5、4、4.5、5,在廢水培養(yǎng)液的COD濃度為12000mg/L,氮源為硫酸銨,C∶N∶P值為100∶5∶1的條件下連續(xù)培養(yǎng)36h,取樣測其絮凝活性。

(5)絮凝劑合成周期的確定:在廢水培養(yǎng)液的COD濃度為12000mg/L,氮源為硫酸銨,C∶N∶P值為100∶5∶1的條件下連續(xù)培養(yǎng),每隔6h取樣測定菌體濃度和絮凝活性。

1.2.3 絮凝活性分布

將發(fā)酵液在3000rpm的轉速下離心30min,得到上清液和菌體(用蒸餾水洗滌后懸浮在與上清液等體積的蒸餾水中),分別取發(fā)酵液、上清液和菌體測定其絮凝活性大小。

1.2.4 MFHJ4的提取工藝

在MFHJ4絮凝劑最優(yōu)合成條件下進行發(fā)酵培養(yǎng),將發(fā)酵液4000rpm離心30min后,取上清液進行減壓蒸發(fā)至原體積的1/10,在濃縮液中加入一定體積預冷提取劑,混勻后在4℃下靜置過夜;析出沉淀物以3000rpm離心10min收集棉絮狀沉淀物,沉淀物用無水乙醇洗兩次,最后使用無水乙醇將沉淀洗入圓底燒瓶,利用旋轉蒸發(fā)儀進行干燥,即得灰白色粉末狀絮凝劑粗制品,記為MFHJ4。

1.2.5 提取工藝條件的確定

(1)提取劑種類的確定:分別采用無水乙醇、丙酮和無水乙醚作為提取劑,在提取劑加入量為上清液體積的2倍,沉淀物在60℃下烘干4h的條件下進行提取,測其產量和絮凝活性。

(2)乙醇加入量的確定:在乙醇加入量分別為上清液體積的1、2、3、4倍的條件下進行提取,測其產量和絮凝活性。

(3)上清液p H值的確定:在上清液p H值分別為 5、6、7、8、9,乙醇加入量為上清液體積的 3 倍的條件下進行提取,測其產量和絮凝活性。

2 結果與討論

2.1 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1 COD濃度的影響

復合型生物絮凝劑產生菌 HJ4在不同COD濃度的廢水發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)后,對高嶺土懸濁液的絮凝效果見圖1。

圖1 培養(yǎng)基COD濃度對HJ4混合菌合成絮凝劑影響

從圖1可見,當COD濃度為120000mg/L時,絮凝率最大,達到87.11%。增大或減小COD濃度,絮凝活性均降低。這是因為當 COD濃度過高時,微生物的生長將受到抑制,而COD濃度太低會導致碳源不足,影響微生物絮凝劑的合成,也會降低絮凝效果[3]。

2.1.2 氮源種類的影響

氮源為微生物合成蛋白質和核酸等物質的原料,對微生物絮凝劑的合成同樣有重要的影響。HJ4菌株在不同氮源下的絮凝效果見圖2。

圖2 氮源種類對絮凝劑合成的影響

由圖2可見,混合菌 HJ4利用硫酸銨、硝酸銨和硫酸銨作為氮源時,絮凝率均可達到70%以上,其中以硫酸銨做氮源時絮凝活性最高,而以尿素作為氮源時絮凝效率較低,僅為31.90%。目前見諸報道的大部分生物絮凝劑產菌,大多利用有機氮或有機氮與無機氮的復合進行絮凝劑合成,僅以無機化合物做氮源生產MBF的報道較少[4]。本研究中僅以硫酸銨作為氮源,就可以使發(fā)酵液的絮凝活性達到90%以上,可能是因為發(fā)酵液中加入硫酸銨后,微生物可以直接吸收、利用NH4+進行生長代謝和絮凝劑的合成;另一方面,制酒廢水為以糧食為原料經微生物發(fā)酵后產生,其中含有大量脂肪酸、無機鹽和生長因子等對產絮菌株生長具有促進作用的物質,因此不需要再補充有機氮。

2.1.3 C∶N值的影響

有研究表明,適宜的碳氮比有助于菌體生長以及胞外分泌物的形成[5]。HJ4菌株在不同碳氮比下的絮凝效果見圖3。由圖3可看出,HJ4混合菌合成絮凝劑的最佳碳氮比為20,高于或低于此值都會使絮凝活性顯著下降。這可能是因為碳氮比較低時(＜20),培養(yǎng)基氮源充足,微生物的代謝重心轉為菌體的生長,不利于絮凝劑的積累;碳氮比高于20時,培養(yǎng)基中的氮源相對較少不利于混合菌的生長和繁殖,同樣不利于絮凝劑的合成;而在碳氮比為20時,有利于HJ4混合菌的菌體生長和絮凝劑合成。

圖3 培養(yǎng)基C∶N對絮凝劑合成的影響

2.1.4 p H值的影響

培養(yǎng)基的p H值可影響微生物細胞表面的帶電狀態(tài)、有機物的離子化程度和發(fā)酵液的氧化還原電位,從而影響菌體對營養(yǎng)物質的吸收及菌體自身代謝酶和產絮凝劑酶的活性。HJ4菌株在不同p H值下的絮凝效果見圖4。

由圖4可以看出,在發(fā)酵培養(yǎng)基初始p H值為3到5的范圍內,發(fā)酵液的絮凝活性均可達到70%以上,當p H值到4.5時發(fā)酵液絮凝活性迅速增長,可達到90%左右。一般酵母菌生長的最佳p H值范圍是4.5～6[6],p H值高于或低于此范圍均會影響菌體的生長和代謝產物的積累。對于 HJ4混合菌,初始p H值為4.5時,菌體生長和絮凝劑合成均處在最佳p H值范圍內,因此其絮凝活性可達到90%以上。

圖4 培養(yǎng)基初始p H值對 HJ4混合菌合成絮凝劑的影響

2.1.5 絮凝劑合成周期的確定

為了確定MFHJ4絮凝劑的合成周期以及絮凝劑合成和菌體生長的關系,本試驗在上述最佳條件下進行 HJ4混合菌的發(fā)酵培養(yǎng),同時測定培養(yǎng)過程中菌體濃度、發(fā)酵液絮凝活性,結果見圖5。

圖5 HJ4產絮凝劑周期曲線

由圖5可知,接種 HJ4混合菌后發(fā)酵培養(yǎng)基既具有一定的絮凝活性,并在0～24小時的培養(yǎng)中,絮凝活性迅速增加,24h時發(fā)酵液絮凝活性達到90.44%;之后隨著培養(yǎng)時間延長,發(fā)酵液絮凝活性變化不大,基本趨于穩(wěn)定。混合菌菌體的生長有類似趨勢,在0～24h內菌體數量迅速增加,菌體生長進入對數期,24h后進入穩(wěn)定期,菌體濃度基本保持不變。

由上面的變化趨勢可以看出,HJ4混合菌絮凝劑的合成和菌體的生長是同步進行的,并在穩(wěn)定期絮凝活性達到最大,說明發(fā)酵液中的絮凝劑是由微生物細胞合成并分泌到胞外,而并非在菌體自溶后才釋放進入培養(yǎng)基的。

2.2 絮凝活性分布

不同絮凝劑產生菌合成的絮凝劑在發(fā)酵液中的分布是不同的,有的附著于細胞表面,有的游離于發(fā)酵液中,有的在細胞內積累,只有當菌體細胞自溶后才能釋放進入發(fā)酵液。為了解絮凝劑產生菌 HJ4的活性分布情況,分別測定了發(fā)酵液及其離心后的上清液和菌體的絮凝活性,結果見圖6。

由圖6可知,HJ4混合菌發(fā)酵培養(yǎng)24h后絮凝活性物質主要存在于上清液中,MFHJ4是利用HJ4混合菌的代謝產物。而細胞懸浮液絮凝效果較低,表明 HJ4混合菌產生的絮凝活性物質大部分分泌至胞外發(fā)酵液中,這為生物絮凝劑的提取提供了方便。

圖6 HJ4絮凝活性分布

2.3 提取條件的確定

2.3.1 不同提取劑的影響

采用2倍體積提取劑對離心發(fā)酵上清液進行沉淀,不同提取劑對絮凝劑MFHJ4的提取效果見表1。

結果表明:用乙醇和丙酮均可快速從發(fā)酵上清液中沉淀出棉絮狀、黃白色絮凝劑。丙酮提取的產量略高于無水乙醇(多0.03g/L),但丙酮屬于低毒性化學試劑,對人體健康有一定的危害,并且丙酮(分析純)的價格是無水乙醇的兩倍多,用于大量提取成本較高。下面的試驗選用無水乙醇作為提取劑。

表1 不同提取劑對MFHJ4產量的影響

2.3.2 無水乙醇加入量的影響

離心發(fā)酵上清液分別在無水乙醇加入體積為1-4倍下進行沉淀,無水乙醇不同加入量的提取效果見圖7。

圖7 無水乙醇不同加入量對MFHJ4凝劑提取效果的對比

由圖可知,無水乙醇加入量對MFHJ4絮凝劑產量有極大影響:隨著無水乙醇加入量增加,絮凝劑產量迅速提高,并在加入量為濃縮液體積三倍時,MFHJ4產量達到3g/L以上。但對產品品質影響較小,4種加入量下制得的產品絮凝活性都在90%左右,活性較高,說明使用無水乙醇提取MFHJ4是通過降低其在溶液中的溶解度而使其沉淀析出,并不會改變其分子結構。綜合考慮,下面的試驗選擇無水乙醇用量3倍體積。

2.3.3 p H值的影響

為了確定p H值對MFHJ4提取的影響,將濃縮后的上清液用稀 HCl和稀NaOH溶液調節(jié)p H值到不同值,在無水乙醇加入量為三倍體積的條件下進行提取。結果見圖8。

圖8 濃縮液的p H值對MFHJ4絮凝劑提取的影響

由圖可知,在酸性條件下,隨著p H值的升高,MFHJ4的產量和絮凝活性迅速升高,當p H值達到7以后,產量和絮凝活性增加并不明顯。MFHJ4的產量隨著p H值的升高而升高,可能會導致MFHJ4中帶負電的功能基團(羧基、羥基等)濃度的增加,從而使MFHJ4表面負電荷增多,最終影響了MFHJ4的特性。發(fā)酵上清液的p H值在7-8的范圍內,因此提取過程不需要調節(jié)p H值。

3 結論

(1)復合型生物絮凝劑產生菌 HJ4利用制酒廢水作為替代培養(yǎng)基的適合培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)基COD濃度為12000mg/l,氮源為硫酸銨,C:N=20:1,初始p H值為4.5,相對接種量15%,培養(yǎng)溫度溫度為30℃,搖床轉速150 r/min,培養(yǎng)時間為24h。所得絮凝劑對高嶺土懸濁液的絮凝率為90.44%。

(2)絮凝劑MFHJ4提取條件簡單,在無水乙醇加入量為上清液體積的3倍,4℃下冷藏過夜,采用旋轉蒸發(fā)儀干燥,每升發(fā)酵液可獲得絮凝劑3.85g。

(3)本試驗以制酒廢水作為替代培養(yǎng)基制取的絮凝劑產率高,具有較高的絮凝活性,對環(huán)境不會造成二次污染,具有廣闊的應用前景。

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[6]沈萍.微生物學.北京:高等教育出版社.2000.

Preparation of Composite Bioflocculant MFHJ4 by Alcohol Wastewater

WangLili,WangXiangdong,TianZhe,LiuWanyu,YeYongjiao
(SchoolofArchitectureandEnvironmentalEngineering,SichuanUniversity,Chengdu,610065)

Strain HJ4 was cultured in alcohol wastewater,and the impact of nutrition and environmental conditions for the production of MBF and types of extractants、p H of concentrated liquid etc.for the extraction of MBF were investigated.The results showed that the optimum conditions for the production of MFHJ4 were asfollows:COD of the alcohol wastewater was 12000mg/L,(NH4)2SO4as nitrogen source,C∶N 20∶1,initial p H 4.5,the temperature 30℃and shaking speed 150rpm;Impact of variousfactors on the best extraction conditions:HJ4 cultured for 24h,concentrated liquid natural p H using ethanol as extracting reagent,ethanol dosage is 3 times the volume of concentrated liquid,and application of this method of p urification-extraction yield reached 3.85g/L.

alcohol wastewater medium;microbial bioflocculant;extraction process;flocculating activity