同一穩態下自由基平衡系統移動調節因子的推測及實驗

潘華山，譚婧，劉剛0

（1.廣州中醫藥大學 體育健康學院，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫藥大學 中藥資源與工程研究中心，廣東 廣州 510006）

同一穩態下自由基平衡系統移動調節因子的推測及實驗

潘華山1，譚婧2，劉剛120

（1.廣州中醫藥大學 體育健康學院，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫藥大學 中藥資源與工程研究中心，廣東 廣州 510006）

采用中等強度持續性水平跑模型，研究了不同時相、不同劑量下抗氧化劑攝入大鼠骨骼肌細胞線粒體MDA、SOD、CAT、GSH-PX等抗氧化酶活性的變化，推測引發自由基穩態水平變化的先導性因子。90只SD大鼠，實驗1隨機分為正常人參皂甙Rb1組、7倍人參皂甙Rb1組、生理鹽水模型組和生理鹽水空白組，每組10只，檢測指標為肌細胞線粒體SOD、MDA、CAT、GSH-PX；實驗2隨機分為空白組、中等強度即刻組、中等強度24 h組、中等強度48 h組、中等強度72 h組，每組10只，運動后即刻、24 h、48 h、72 h后取材，檢測指標同實驗1。結果發現：正常劑量人參皂甙組、7倍劑量人參皂甙組與生理鹽水空白組相比抗氧化酶的活性顯著增加。提示：運動應激過程中機體氧化能力的增高伴隨著機體抗氧化能力的提高，但空白刺激條件下機體抗氧化能力的增強沒有逆向引發自由基穩態系統反應。進一步推測：氧化能力是自由基穩態水平移動的先導因素，而外源性引發抗氧化能力提高對自由基積累無負反饋效應。

運動生化學；運動應激；自由基；同穩態；調節因子

自由基是需氧生物在生物氧化過程中利用分子氧作為電子受體而產生的一類特殊的小分子(或離子)基團，它對正常的生物大分子蛋白質、核酸及生物膜脂類等產生破壞性過氧化作用[1]，同時需氧生物體內也產生超氧化物岐化酶(SOD)、過氫化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶清除過量的自由基，使自由基的存在達到一個適量的水平，從而形成同一穩態下的自由基平衡機制。

探索與發現同一穩態下的自由基平衡系統變化的調節因子，將為研究外源性物質特異性抗氧化，特別是精確抑制某些危害性較大自由基堆積提供更為清晰的理論假說基礎，因此了解調節自由基與抗氧化酶穩態系統的先導因子具有重要的基礎性意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

實驗1：5月齡SPF級雄性SD大鼠40只(實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2008-0085，廣州中醫藥大學實驗動物中心，體重180～220 g)。隨機分為正常劑量人參皂甙Rb1組(50 mg·kg-1·d-1)、7倍人參皂甙Rb1組(350 mg· kg-1·d-1)、生理鹽水運動組(50 mg· kg-1·d-1生理鹽水)和生理鹽水空白組(50 mg·kg-1·d-1生理鹽水)，每組10只，常規分籠喂養，自由飲水進食，動物室內溫度 21～24 ℃，相對濕度40%～55%，室內空氣流通，光照時間l2 h。

實驗2：5月齡SPF級雄性SD大鼠50只(同實驗1)。隨機分為空白對照組、運動中等強度即刻組、運動中等強度24 h組、運動中等強度48 h組、運動中等強度72 h組，每組10只，喂養及其他條件同實驗1。

所有動物實驗前均未進行過跑臺跑運動。實驗過程對動物的處置符合山內鐘平[2]所著《實驗動物的環境與管理》要求。

1.2 動物模型

實驗 1：僅生理鹽水運動組進行中等強度持續性水平跑運動。運動強度根據 Bedford的最大攝氧量確定，運動強度超過90%最大攝氧量為大強度運動，運動強度相當于60%～70%最大攝氧量為中等強度運動。速度16 m/min，20 min，坡度0°，間歇40 min，灌胃后1 h開始運動，每次20 min，每天1次，連續4 d。運動中采用聲音刺激或毛刷機械刺激鼠尾部，以防止大鼠停止運動。但實驗過程中，未使用該刺激。造模過程中1只大鼠死亡。

實驗 2：所有組別均進行中等強度持續性水平跑運動。速度16 m/min，20 min，坡度0°，間歇40 min，灌胃后1 h開始運動，每次20 min，每天1次，連續14 d。其他做法同實驗1。

1.3 用藥情況

實驗1：灌胃劑量依據王華等[3]制定的藥理實驗設計中劑量確定的方法和原則，并參考唐暉等[4]相關研究中的給藥劑量而確定，50 mg/kg，1日1次。其余2組同等劑量生理鹽水灌胃。大鼠2 d稱重1次，按照新的體重確定灌胃劑量。

實驗2生理鹽水灌胃劑量同實驗1。

1.4 動物取材及標本制備

各組運動結束后，腹腔注射戊巴比妥納溶液麻醉動物，麻醉劑量為0.25～0.5 g/kg。迅速取出右側肱三頭肌，剔除筋膜等結締組織，冰冷生理鹽水清洗，并迅速放入液氮冷凍，后放入-80 ℃低溫冰箱儲存待測。

線粒體制備：稱取1.5 g肌組織，在冰浴上剪成碎塊，按質量體積比1 g∶4.5 mL的比例加入事先預冷的緩沖液(0.25 mol/L蔗糖+0.01 mol/L Tris)制備成組織勻漿(4 ℃)。勻漿液在高速冷凍離心機(SIGMA 6K 15，Germany)內經500 g離心20 min去除胞核碎片后，取上清液在高速冷凍離心機(SIGMA 3K 30，Germany)內以3 500 r/min離心15 min，得到組織上清液和線粒體兩部分。將線粒體懸于0.5 mL的緩沖液(0.25 mol/L蔗糖+0.01 mol/L Tris)中待測。以上步驟均在0～4 ℃環境中進行。

1.5 藥品、主要試劑與儀器

人參皂甙 Rb1由上海同田生物技術有限公司提供。MDA含量測定試劑盒，SOD、GSH—Px、CAT活性測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。主要儀器：高速冷凍離心機(SIGMA，Germany)、ZH-PT動物實驗跑臺。

1.6 指標測定

丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定；SOD采用黃嘌呤氧化酶法測定；GSH-PX采用DTNB法測定。對各項指標的測定嚴格按照試劑盒說明書進行，測定完畢后按說明書計算所測指標濃度、活性。

1.7 統計學分析

實驗數據均采用SPSS16.0統計軟件進行處理，采用單因素方差分析進行各組間的差異顯著性檢驗，顯著性水平為P<0.05。

2 結果及分析

2.1 抗氧化劑攝入后骨骼肌線粒體MDA濃度，抗氧化酶酶活性變化

生理鹽水運動組與生理鹽水空白組比較，MDA濃度，SOD、GSH-PX活性明顯增高，差異具有顯著性意義(P<0.05)；CAT活性有所升高，但差異無顯著性意義；正常劑量組、7倍劑量組與生理鹽水空白組比較，空白組MDA濃度略微高于正常劑量組和7倍劑量組，但這些差異均沒有顯著性意義，正常劑量組、7倍劑量組與生理鹽水空白組比較抗氧化酶的活性顯著增加，差異具有顯著性(見表1)。

表1 抗氧化劑攝入后骨骼肌線粒體MDA濃度與抗氧化酶活性（x±s）的變化

2.2 各組不同時相骨骼肌線粒體MDA濃度，SOD、CAT、GSH-PX酶活性變化

大鼠在中等強度運動后即刻應激氧化產物 MDA濃度達到峰值，與空白組相比明顯增高，差異具有顯著性意義，而SOD、CAT、GSH-PX、GSH活性在24 h達到峰值，72 h后MDA濃度、SOD、CAT、GSH-PX、GSH活性恢復，72 h組與空白組比較，差異無顯著性(見表2)。

表2 不同時相骨骼肌線粒體MDA濃度，SOD、CAT、GSH-PX酶活性變化

3 討論

1)假說基礎。

運動過程中隨著機體對氧的需求加大，并通過加大、加深呼吸的方式攝入更多氧，在這一過程中必然伴隨著電子泄漏轉化為自由基離子，引起自由基離子聚集[5]，并由于這一過程與運動需氧的共生性，該過程幾乎是不可分離的。同時機體調節抗氧化酶表達與活性，通過抗氧化酶的催化反應，將自由基轉化為某些無害或低害物質，緩沖運動應激過程中自由基聚集對細胞質膜流動性等產生某些功能性損害，從而形成自由基堆積的內源性對抗體系。

Ji LL等[6]在機體存在自由基的產生與對抗現象的基礎上提出氧化-還原內穩態概念，我國學者劉承宜等[7-8]開創性地提出了運動訓練領域中的內穩態理論，該理論的提出首次從宏觀角度將運動能力的維持與機體內穩態聯系起來，同時從代謝組學等微觀角度證明了運動能力存在內穩態的現象[9]。劉承宜等[7]研究將氧化-還原內穩態分為不同層次的穩態水平，認為運動成績是由SESH的品質決定的。SESH的品質越高，運動水平越高。從自由基平衡系統穩態縱向躍遷的角度而言，高層次(高品質)的平衡穩態較低層次(低品質)的穩態有著更好的運動能力，整體上機體能夠更快更好地達到氧化能力與還原能力的平衡，這個移動是屬于縱向的。

而同一穩態下機體氧化能力與還原能力本身是一個相對穩定的對抗體系，表現為微觀上機體氧化能力與還原能力在不同條件下兩種能力的不同變化。即自由基平衡系統同一穩態下的水平移動(不是低層次到高層次的縱向移動)。

本文的假說也是在同一穩態條件下作為基礎的。

2)不同劑量抗氧化劑攝入后骨骼肌線粒體 MDA濃度，SOD、CAT、GSH-PX酶活性變化。

實驗 1表明：生理鹽水+運動組較生理鹽水空白組，MDA濃度增高，差異具有統計學意義，SOD、 GSH-PX活性顯著升高，CAT活性有所增高，提示機體運動應激過程中自由基大量聚集，機體氧化能力增強；與之對抗的抗氧化酶活性提高，抗氧化能力增強，可以認為，自由基平衡系統中機體氧化能力提高對機體還原能力(抗氧化酶活性)有正向調節作用。

正常劑量人參皂甙組、7倍劑量組與生理鹽水空白組比較抗氧化酶的活性顯著增加，提示外源性抗氧化劑增強了機體還原能力。而正常劑量組、7倍劑量組與空白組比較，正常劑量、7倍劑量人參皂甙組與生理鹽水空白組MDA濃度差異不具顯著性，機體氧化能力沒有增強。提示機體抗氧化能力的增強沒有反向引起機體氧化產物MDA濃度的升高，即機體抗氧化能力的增強沒有逆向引發自由基穩態系統反應。

據此可推測，伴隨著體內各種抗氧化酶活性的提高是機體自我調節對自由基聚集的應答表現，自由基平衡系統中機體還原能力提高對機體氧化能力無逆向調節作用。運動應激過程中機體氧化能力可能是同一穩態層次下自由基平衡系統水平移動的關鍵調節因子，同一穩態層次下自由基平衡系統可能是一個單向調節系統。

3)不同時相骨骼肌線粒體MDA濃度，SOD、CAT、GSH-PX酶活性變化。

為進一步證明運動應激過程中機體氧化能力可能是同一穩態層次下自由基平衡系統水平移動的調節因子的推測，本課題組測試了運動刺激后不同時相間機體氧化產物MDA及各種抗氧化酶等相關指標。

中等強度運動后即刻組與空白對照組比較：應激氧化產物MDA濃度、抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX活性持續增高具顯著性，24 h組與即刻組相比，應激氧化產物 MDA濃度下降，抗氧化酶 SOD、CAT、GSH-PX活性上升，大鼠在中等強度運動后即刻應激氧化產物MDA濃度達到峰值，而SOD、CAT、GSH-PX、GSH活性在24 h達到峰值、72 h后MDA濃度，SOD、CAT、GSH-PX、GSH活性恢復至空白組水平，差異不具顯著性。該現象提示，在運動應激過程中，自由基離子的積累相對于機體抗氧化能力的提高具有前導性，運動應激過程中自由基離子的生成速率大于機體抗氧化酶清除自由基的速率，認為抗氧化酶活性提高作為機體應答自由基聚集的主要反應具有一定滯后性。進一步證明同一穩態層次下自由基平衡系統水平移動的調節因子這一推測。

從自由基引發的機信號通路激活角度來看，有證據顯示在細胞基因表達調控中存在一些對氧化還原敏感的轉錄因子在氧化脅迫條件下被氧化而活化的過程[10]。自由基與抗氧化酶之間的平衡存在一個保守的氧化脅迫感應機制，在這個感應機制中，自由基大量積累，氧化脅迫信號通過巰基/二硫鍵轉換反應使轉錄因子活化，激活抗氧化基因的表達。可以認為自由基的大量積累導致氧化能力的增強，當機體氧化能力到達一個閥值時，巰基/二硫鍵轉換開關開啟，調高抗氧化酶的轉錄活性，增強機體抗氧化能力，支持了氧化能力是自由基平衡系統水平移動調節因子的推測。

綜上所述，機體自由基堆積，機體氧化能力增強，抗氧化酶活性提高，但當機體抗氧化酶活性提高、機體抗氧化能力增強時，MDA基本不變化，機體抗氧化能力的增強沒有逆向引發自由基穩態系統反應；機體還原能力較氧化能力具一定的滯后性，因此可認為：運動應激過程中機體氧化能力可能是同一穩態下自由基平衡系統的調節因子，且同一穩態下自由基平衡系統的調節可能是單向的。

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Inference and experiment of the regulating factor of the movement of the free radical balancing system in the same stable state

PAN Hua-shan1，TAN Jing2，LIU Gang1
（1.School of Sport and Health，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2.Chinese Resources and Research Center，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

By using a continuous medium intensity horizontal running model, the authors studied the dynamic changes of the activity of anti-oxidation enzymes such as MDA, SOD, CAT and GSH-PX in the mitochondrion of skeletal muscle cells of rats taking in different dosages of antioxidant at different times, and inferred the lead factor that triggered the change of the level of stability of free radicals. The authors randomly divided 90 SD rats into a normal ginsenoside Rb1 group, a septuple ginsenoside Rb1 group, a physiological saline model group, and a physiological saline control group with 10 rats in each group in experiment 1, in which the test indexes were the SOD, MDA, CAT and GSH-PX in the mitochondrion of muscle cells, and into a control group, a medium intensity immediate group, a medium intensity 24h group, a medium intensity 48h group, and a medium intensity 72h group with 10 rats in each group in experiment 2. The author revealed the following finding: as compared with the physiological saline control group, the activity of antioxidant enzymes of rats in the normal ginsenoside group and the septuple ginsenoside group increased significantly, which suggested that during kinetic stressing the increase of the body’s anti-oxidation capacity was accompanied by the enhancement of the body’s anti-oxidation capacity, but the increase of the body’s anti-oxidation capacity under the stimulation free condition did not reversely trigger the reaction of the free radical stabilization system. The author further inferred that oxidation capacity is the lead factorfor the horizontal movement of free radicals, while the enhancement of anti-oxidation capacity triggered exogenously has no negative feedback effect on the accumulation of free radicals.

sports biochemistry；kinetic stress；free radical；the same stable state；regulating factor

G804.55

A

1006-7116(2010)07-0086-04

2009-08-08

廣東省科技廳科技計劃項目(2006B35604006)。

潘華山（1968-），男，研究員，碩士研究生導師，研究方向：中藥抗運動疲勞。