田皂角組織培養及無性系建立的研究

摘要:以生長非常旺盛的田皂角嫩莖為外植體，進行愈傷組織誘導和分化、試管苗的生根和移栽的研究，成功地建立起田皂角的無性系。結果表明:MS+BA0.8 mg/L +2，4-D1.2 mg/L是田皂角嫩莖愈傷組織誘導培養和繼代培養的理想培養基;MS+AgN031.0 mg/L +BA1.0 mg/L +NAA0.1 mg/L是田皂角愈傷組織和不定芽分化培養的理想培養基;1/2MS+IAA0.4 mg/L +NAA0.1 mg/L是田皂角試管苗生根培養和生根繼代培養的理想培養基;移植的試管苗生長旺盛、根系發達，當年可正常開花結果，其所有的植物學性狀保持不變。

關鍵詞:田皂角;愈傷組織;無性系

中圖分類號:S567.21+9文獻標識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.02.010

Tissue Culture and Establishment of Regeneration System of Aeschynomene indica

WANG Xiao-ping

(Dalian Education University，Dalian， Liaoning 116021，China)

Abstract:The induction and differentiation were studied on the callus of young stem of Aeschynomene indica as well as rooting and transplanting of tube plantlets. And the establishment of regeneration system of Aeschynomene indica was successfully carried out in the experiment. The results showed that the optimal media were obtained about regeneration system of Aeschynomene indica. They were the medium of MS+BA0.8 mg/L+2，4-D1.2 mg/L for callus induction and subculture of young stem; the medium of MS+AgN031.0 mg/L+BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L for differentiation of callus and adventitious buds; the medium of 1/2MS+IAA0.4 mg/L+NAA0.1 mg/L for rooting and roots subculture of tube plantlets. The tube plantlets were with the vigorous and variant characters.

Key words: Aeschynomene indica; callus; clone

田皂角(Aeschynomene indica)又稱合萌，屬于豆科田皂角屬一年生草本植物[1]，生長于田野濕地、向陽草地、河岸沙地等;在朝鮮、日本、亞洲的熱帶以及大洋洲有分布;在中國的華中、華南、華東、西南及東北有分布[2]。全草入藥，具有消腫解毒、清熱消滯、利濕、明目、消腫等功效，能治水腫腹脹、小便不利、黃疸、痢疾、熱淋、血淋、腫毒、夜盲癥、支氣管炎、濕疹、瘡癤、外傷出血、蛇咬傷等疾病;煎湯洗患處治蕁麻疹，鮮草搗爛外敷可治外傷。同時還可以作為獸藥使用，能治牛肺炎、咳嗽等病癥[3-5]，也可以作為滅虱子等殺蟲劑。在中國的南方，也將輕軟的木質化莖作為制作救生圈、游泳帶和瓶塞等的原料。由于田皂角具有重要的價值，近年來的需求量越來越大，人們需要大量的采收，而由于生態環境不斷破壞，野生的資源卻越來越少。為保護田皂角的野生資源，為該植物的生物技術研究提供支撐，為其基因庫的建立提供科學依據，我們對其進行了組織培養和無性系建立的研究。雖然目前國內已多有豆科植物組織培養研究的報道[6-12]，但迄今未見田皂角組織培養研究的報道。

1材料和方法

1.1材料及滅菌

將大連市郊區草地上生長非常旺盛的田皂角嫩莖采回，作為進行研究的材料。將采回來的嫩莖除掉葉片后，剪成長4～5 cm的莖段，放到500 mL的磨口廣口瓶中，流水沖洗40 min左右，用0.05%安利溶液振蕩洗滌約30 min后，移到超凈工作臺上，用70%～75%的乙醇滅菌10 s，立即用無菌水洗滌兩次，再用0.05%的HgCl2溶液振蕩滅菌3 min，接著用0.025%的HgCl2溶液振蕩滅菌13 min，再用無菌水振蕩清洗5次，即可獲得無菌嫩莖。

1.2培養條件

培養基以MS、1/2MS、1/3MS、B5、White、N6和LS為基本培養基，附加不同濃度的細胞分裂素BA和生長素NAA、IBA、2，4-D和IAA。以MS為基本培養基時，加蔗糖30 g/L;以1/2MS為基本培養基時，加蔗糖15 g/L。培養基胨力強度為180 g/cm2[13]、pH5.8~6.0，培養溫度20~26 ℃，光照12 h/d左右，光照度2 000 lx左右。

1.3試驗方法

1.3.1愈傷組織的誘導培養將田皂角無菌嫩莖切成約0.2 cm的莖段，接種到不同濃度激素配比的MS培養基中進行愈傷組織的誘導培養，在無光照的條件下培養25 d，再轉移到光照下培養35 d后進行統計觀察。每種處理接種100個材料。愈傷組織誘導試驗重復4次。

1.3.2愈傷組織分化培養將上述繼代培養的顆粒狀愈傷組織分散為獨立的顆粒后，接種到附加不同種類不同濃度植物激素的MS+AgN031.0 mg/L培養基上，在光照條件下進行愈傷組織的分化培養。愈傷組織分化培養試驗重復4次。每種處理接種100個材料。培養50 d觀察統計。

1.3.3試管苗生根培養將繼代培養生長旺盛的不定芽從基部剪下，分別接種到以MS、1/2MS、1/3MS、B5、White、N6和LS為基本培養基，附加IAA0.4 mg/L +NAA0.1 mg/L生根培養基上進行生根培養。生根培養試驗重復4次。每種處理接種100個材料。培養30 d觀察統計。

1.3.4試管苗的移栽將培養生根試管苗的培養瓶瓶塞打開，放到4 000～5 000 lx左右的光照下煉苗4 d后，用鑷子將試管苗從培養瓶中取出，立刻用20 ℃以上的清水洗去根部的培養基，然后移栽到上面鋪有一層約7 cm厚的爐灰渣、下層為肥沃園土的溫室苗床上。移栽后前14 d保持在溫度20～29 ℃、濕度95%左右、沒有直射光照的環境條件下。25 d時觀察統計。移栽試驗重復4次，每次移栽200株。

2結果與分析

2.1不同培養基對愈傷組織誘導的影響

將莖段接種在附加不同激素的MS培養基上暗培養，由于切口損傷部位直接接觸到培養基，培養20 d左右，切口表面張裂，長出較為松散的淡黃色愈傷組織，繼續培養到25 d時轉移到光照下培養。在含有2，4-D和NAA的培養基上都能逐漸形成愈傷組織。但培養基不同，所形成的愈傷組織不同。由表1可見，不同濃度BA與不同濃度的2，4-D、NAA配合使用都能誘導嫩莖產生愈傷組織。從愈傷組織的誘導率和外部形態看，在MS+BA0.8 mg/L +2，4-D1.2 mg/L這一培養基上，不僅愈傷組織的誘導率達到了88%，而且所形成的愈傷組織為綠色的顆粒狀，這種愈傷組織為具有分化力的愈傷組織[14]。把這種愈傷組織在同一培養基上進行繼代培養，每次重復試驗連續繼代培養7代的結果都表明，不僅愈傷組織的外部形態保持不變，而且繼代培養周期縮短為50 d，顆粒狀愈傷組織的增殖率達到了21.6倍。這說明MS+BA0.8 mg/L +2，4-D1.2 mg/L這一培養基是田皂角嫩莖愈傷組織誘導培養和繼代培養的理想培養基。

2.2不同濃度激素對愈傷組織分化培養的影響

表2表明，在不含激素、BA含量為1.5 mg/L時，NAA的含量分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/L的培養基上培養的愈傷組織不能分化。在BA含量分別為0.5 mg/L和1.0 mg/L，NAA的含量分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/L的培養基上培養的愈傷組織均能分化。其中在BA1.0 mg/L +NAA0.1 mg/L這一培養基上不僅愈傷組織顆粒分化率達93%，而且分化的不定芽長勢好。觀察還表明，在BA1.0 mg/L +NAA0.1 mg/L這一培養基上培養10 d可見開始分化，隨后，隨著分化數的增加、分化不定芽生長，在已經分化的不定芽基部又會分化生長出3～9個不定芽，使分化的不定芽呈叢生狀。把由顆粒狀愈傷組織分化培養的不定芽從基部剪下后，接種到相同培養基上進行不定芽的分化培養，經過45 d培養，接種培養的每個不定芽平均會分化增殖5.1個高0.5 cm以上的不定芽。接著，把由不定芽分化培養的不定芽接種到相同的培養基上，進行不定芽分化繼代培養，每個重復試驗經過連續6次的繼代培養，其分化率和分化的不定芽長勢基本不變。上述說明，MS+AgN031.0 mg/L +BA1.0 mg/L +NAA0.1 mg/L這一培養基是田皂角愈傷組織和不定芽分化培養的理想培養基。

2.3 不同濃度激素對生根培養的影響

統計結果表明:在以1/2MS為基本培養基，附加IAA0.4 mg/L+NAA0.1 mg/L生根培養基上，91%的培養不定芽能生長為具有3～7條根的試管苗。觀察還表明，在以1/2MS為基本培養基，附加IAA0.4 mg/L +NAA0.1 mg/L生根培養基上，培養10 d左右，大部分培養材料會形成根原基。培養到30 d時，每株生根試管苗就會生長為高4 cm左右、具有5～8個葉片、葉色濃綠、莖粗0.12～0.2 cm的旺盛試管苗。把在這一培養基上培養的生根試管苗剪成長1～1.5 cm、至少具有一個葉片的莖段，接種到上述生根培養基上進行生根繼代培養，經過25 d的培養，又可以培養成株高4～5 cm、生長旺盛的生根試管苗。利用這種生根繼代的方法培養的試管苗生長旺盛，幾乎沒有無效苗，25 d的繁殖系數為3.0。這說明1/2MS+IAA0.4 mg/L +NAA0.1 mg/L這一培養基是田皂角試管苗生根培養和生根繼代培養的理想培養基。

2.4生根試管苗的移栽

25 d時觀察統計表明:移栽成活率為94%。觀察表明，移栽的試管苗前期生長速度較慢，但根系較為發達。觀察還表明，移栽后10 d成活，16 d左右開始正常生長。上述說明，爐灰渣是田皂角試管苗移栽的理想基質。

5月中、下旬把在溫室中移栽成活的試管苗移植到河邊草地上，移植成活率幾近100%。10月下旬觀察表明，與野生植株相比，試管苗具有長勢整齊旺盛，根系增加1倍左右、當年可正常開花結果，但開花和結果時間晚30 d左右的特點，其他植物學性狀與野生植株一致。

3討論

本研究以田皂角的嫩莖為材料，成功地進行了組織培養研究，并建立起嫩莖無性系。這不僅為該植物的人工保護提供了可能，而且也為其轉基因研究和信息庫的建立提供了科學依據，同時還證明了田皂角的非分生組織和細胞也具有全能性。

田皂角嫩莖愈傷組織繼代增殖培養50 d，顆粒狀愈傷組織可增殖21.6倍。按照這個速度計算，一年的增殖數為157.68倍;用不定芽分化的方法進行增殖，經過 45 d的培養，可增殖5.1個不定芽。按照這個速度計算，一年可繁殖約5.18個后代;用生根繼代的方法進行增殖培養，25 d的繁殖系數為3.0。按照這個速度，每年繁殖數約為314株。這說明不論采用上述哪種方法進行繁殖，其繁殖速度都可以滿足人們對大量種苗的需求。由于通過生根繼代方法培養的試管苗根系發達、生長旺盛、沒有無效苗。因此，生產上應采用生根繼代的方法進行快速繁殖。當然，分化率達93%顆粒狀的愈傷組織，也可以直接作為轉基因的研究材料。

與野生植株相比，當年栽培的試管苗出現了開花和結果晚30 d左右的特點。這主要是由下述原因引起的:栽培的試管苗根系非常發達(增加1倍左右)，從而促進了植株的旺盛生長，導致出現了非常旺盛的營養生長抑制了生殖生長、使開花結果時間延遲的現象。

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