酶法提取蟬擬青霉多糖的研究

摘要:用正交優(yōu)化的方法分別研究木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶對蟬擬青霉多糖得率的影響。結(jié)果表明，木瓜蛋白酶法提取的多糖產(chǎn)量最高，其最佳提取條件是:溫度50 ℃、pH7、木瓜蛋白酶1%、酶作用時間2 h。

關(guān)鍵詞:蟬擬青霉;多糖;木瓜蛋白酶;纖維素酶;果膠酶;正交優(yōu)化

中圖分類號:Q93-335文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.02.011

Study on the Enzyme-extraction Method of Polysaccharide from Paecilomyce cicadae

LIU Yun1， TAN Ai-juan1， LV Shi-ming2

(1.College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang， Guizhou 550025，China;2.College of Animal Sciences， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025，China)

Abstract:Effects of papain， cellulase and pectase on extraction rate of polysaccharide from Paecilomyce were determined in orthogonal test. The results showed that the polysaccharide content extracted by papain was the highest among three enzyme-extraction method， and its optimal extraction conditions were 1 % papain， 50 ℃ and pH 7， 2 h with papain treating.

Key words: Paecilomyce;polysaccharide;papain;cellulose;pectase;othognoal optimization

蟬花是一些蟬的土棲若蟲受到蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)等真菌寄生的產(chǎn)物，是中國三大名貴藥用蟲草之一。陳祝安[1]和劉廣玉等[2]證明，蟬擬青霉及人工培養(yǎng)物有明顯的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和解熱等功效，且其作用與天然蟬花和冬蟲夏草(Cordyceps)相似 。金麗琴[3]、陳秀芳等[4]證明，蟬擬青霉能激活大鼠腹腔與肺泡巨噬細(xì)胞，具有增強(qiáng)大鼠免疫能力、改善脂類物質(zhì)代謝和保護(hù)臟器組織的作用。作為名貴中藥材蟬花的無性型，蟬擬青霉發(fā)酵菌絲體含有天然蟬花相似的各種化學(xué)成分，而且其主要活性成分多糖的含量明顯高于天然蟬花[5]，因而蟬擬青霉發(fā)酵菌絲體可以替代天然蟬花用于醫(yī)藥和滋補(bǔ)保健品。

筆者以熱水浸提方法為基礎(chǔ)，比較木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶對提取蟬擬青霉菌絲體多糖得率的影響，以優(yōu)化蟬擬青霉多糖的提取工藝。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株蟬擬青霉GZDXIFR 4718菌株，采自貴州省梵凈山自然保護(hù)區(qū)，由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離、鑒定、保存。

1.1.2培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g切塊，用水煮沸30 min，加蔗糖20 g、瓊脂20 g、蛋白胨0.5 g，水補(bǔ)足1 000 mL，pH自然。液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，酵母膏5 g，K2HPO4 1 g/L，水補(bǔ)足1 000 mL，pH6.5。

1.1.3主要試劑木瓜蛋白酶(2 000 μg)、纖維素酶(60 000 μg)、果膠酶(40 μg):均為上海譜振生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。苯酚、濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇等均為分析純試劑。

1.1.4主要實驗儀器滅菌鍋、分光光度計、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、搖床、恒溫培養(yǎng)箱、烘箱、微量移液器、電子天平、旋渦混合器、人工培養(yǎng)箱等。

1.2方法

1.2.1菌絲體制備將蟬擬青霉(GZDXIFR 4718)菌株活化，經(jīng)過固體斜面培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)，離心，收集濕菌絲體，50 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎。

1.2 2多糖含量測定(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。稱取干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖 99.5 mg，定容至100 mL，吸取6 mL轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶定容，即得 0.119 4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0 mL，補(bǔ)蒸餾水至2 mL，再分別加 1 mL 5%苯酚、5 mL濃硫酸，迅速搖勻冷卻后于 485 nm處測光吸收值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出回歸方程。

(2)待測液多糖含量測定。采用苯酚-硫酸法[6]:吸取2 mL 經(jīng)適當(dāng)稀釋后的多糖樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線操作步驟測光吸收值，計算蟬擬青霉多糖得率。

查標(biāo)準(zhǔn)曲線(mg) ×稀釋倍數(shù)

多糖含量(mg) = ×100%

多糖得率(%)

1.2.3熱水提取法提取蟬擬青霉多糖稱取干燥菌絲體2.00 g，加入20 mL水，50 ℃下加熱浸提2.5 h，提取液以3 000 r/min的速度離心15 min，取上清液，濃縮。加95%乙醇使其濃度達(dá)60%，靜置72 h取沉淀。沉淀用無水乙醇清洗，蒸餾水溶解后按Sevage法[7]脫蛋白，再用95%乙醇沉淀多糖，沉淀用無水乙醇洗滌，再用蒸餾水溶解，定容至100 mL，稀釋5倍，苯酚-硫酸法測多糖含量。

1.2.4酶對多糖得率的影響(1)木瓜蛋白酶。用木瓜蛋白酶對蟬擬青霉菌絲體進(jìn)行4因素3水平的正交酶解試驗(正交因素水平如表1)，再進(jìn)行熱水提取法提取多糖，用苯酚-硫酸法測多糖含量。

(2)纖維素酶。用纖維素酶對蟬擬青霉菌絲體進(jìn)行4因素3水平的正交酶解試驗(正交因素水平如表2)，再進(jìn)行熱水提取法提取多糖，用苯酚-硫酸法測多糖含量。

(3)果膠酶。用果膠酶對蟬擬青霉菌絲體進(jìn)行4因素3水平的正交酶解試驗(正交因素水平如表3)，再進(jìn)行熱水提取法提取多糖，用苯酚-硫酸法測多糖含量。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為A = 11.141C + 0.023 6，R2 = 0.998 1，其中A 為吸光度值，C(mg/mL)為葡萄糖濃度，線性范圍為0.011 9～0.119 4 mg/mL。

圖1 苯酚-硫酸法測定葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2熱水提取

熱水法提取多糖的結(jié)果如表4所示，在50 ℃條件下提取2.5 h的多糖得率為1.05%。

2.3酶對多糖得率的影響

2.3.1木瓜蛋白酶影響因素大小為:溫度>pH>時間>木瓜蛋白酶用量。根據(jù)表5可知，最佳正交條件為:溫度為50 ℃，pH為7，作用時間為2 h，酶用量為1%。

2.3.2纖維素酶影響因素大小為:溫度>pH>時間>纖維素酶用量。據(jù)表6可知，最佳條件為:酶用量為0.5%，pH為6，溫度為50 ℃，作用時間為2.5 h。

2.3.3果膠酶影響因素大小為:pH>溫度>時間>酶用量。據(jù)表7可知，其最佳條件為酶用量為1.2%，pH值為5，溫度為40 ℃，反應(yīng)時間為2 h。

3討論

以熱水提取法為對照，加入3種酶能不同程度地提高蟬擬青霉多糖得率，其中木瓜蛋白酶效果最顯著。

用木瓜蛋白酶和纖維素酶分別處理的蟬擬青霉，其多糖得率可分別提高3.1倍(表5第2組)和2.3倍(表6第6組)，作用時間可縮短0.5 h。木瓜蛋白酶是一種在酸性、中性、堿性環(huán)境下均能分解蛋白質(zhì)的蛋白酶，此酶主要是以內(nèi)肽酶的形態(tài)起作用，其最佳條件是溫度為50 ℃，pH為6，作用時間為2 h，酶用量為1%。采用正交試驗優(yōu)化后的提取工藝，一次提取率較高，耗時較短。果膠酶對提高多糖得率的效果不明顯。

參考文獻(xiàn):

[1] 陳祝安.蟬花的人工培養(yǎng)及其藥理作用研究[J].真菌學(xué)報，1993，12(2):138-144.

[2] 劉廣玉，胡菽英.天然蟬花和人工培養(yǎng)品鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用的比較[J].現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1991，8(2):5-8.

[3] 金麗琴，呂建新，袁謙，等.蟬擬青霉對大鼠免疫功能和血液生化指標(biāo)的影響[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，12(31):6.

[4] 陳秀芳，金麗琴，呂建新，等.蟬擬青霉對大鼠腹腔及肺泡巨噬細(xì)胞的激活作用[J].中國病理生理雜志，2002，18(6):694-697.

[5] 劉森琴，溫魯，夏敏.人工培育蟬花的活性成分含量測定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(2):429.

[6] 張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州:浙江大學(xué)出版社，1995:16.

[7] Lowry O H， Rosebrough N J， Rarr A L， et al. Protein measure-ment with the follin pheol reagent[J].J Biol Chem， 1951，193: 265-275.