UVB誘導(dǎo)人皮膚成纖維細胞中beta-catenin基因的變化研究

[摘要]目的:觀察中波紫外線(UVB)誘導(dǎo)人皮膚成纖維細胞中β-catenin及其下游基因c-myc的變化，探討其在紫外線誘導(dǎo)光老化和腫瘤發(fā)生中的作用。方法:使用組織塊法分離培養(yǎng)原代成纖維細胞，使用第2～8代人皮膚成纖維細胞進行紫外線處理，倒置熒光顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)改變，β-gal半乳糖苷酶細胞衰老試劑盒染色衰老細胞、western blot檢測衰老相關(guān)蛋白P16的表達，western blot 檢測紫外線處理人皮膚成纖維細胞各時相點β-catenin、c-myc蛋白表達水平，RT-PCR檢測紫外線處理人皮膚成纖維細胞各時像點β-catenin、c-myc mRNA水平的表達變化。結(jié)果:40 mJ/cm2UVB單次照射后可以誘導(dǎo)人皮膚成纖維細胞衰老，β-gal衰老染色陽性率達到約90%，衰老相關(guān)基因P16蛋白表達明顯升高，β-catenin、c-myc 蛋白表達水平和mRNA水平照射后較未照射組均明顯降低。結(jié)論:紫外線UVB處理人皮膚成纖維細胞可以誘導(dǎo)其發(fā)生衰老改變，衰老細胞中β-catenin、c-myc表達水平明顯降低，這些結(jié)果與皮膚黑色素細胞瘤相關(guān)基因改變的研究相近，為以后皮膚惡性腫瘤的研究提供了線索。

[關(guān)鍵詞]人皮膚成纖維細胞;光老化;beta-catenin;c-myc

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)05-0704-04

The study of beta-catenin change in human fibroblast induced by UVB irradiation

HU Xiao-hui， GAO Feng-hou，F(xiàn)ANG Yong

(Department of Burn Plastics，NO.3 People'Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 201900，China)

Abtract: ObjectiveTo observe the change of beta-catenin and its follow gene c-myc in human fibroblast after induced by UVB，exploure their roles at UVB induced photoaging and cancer.MethodsIsolation and culture human skin fibroblast by tissues methods，fibroblasts were irradiation at different dose UltravioletB，observation the cells'morphology under the invert microscope. Senescence cells were stained by β-galactosidase kit，the level of P16 protein were measured by western blot. The protein and mRNA level of beta-catenin，c-myc by western blot at different time points after UVB irradiation.ResultsFibroblast senescence can be induced by ultravioletB irradiation at 20、40 mJ/cm2，the stain positive ration arrived at about 90%.The protein level of P16 increased obviously following times.The protein and mRNA level of beta-catenin and c-myc decreased obviously after UVB irradiation compared to control.ConclusionThe beta-catenin and c-myc gene decrease in Human skin fibroblasts after induced by ultravioletB irradiation.

Key words: human skin fibroblast;photoaging;beta-catenin;c-myc

紫外線照射以后可以誘導(dǎo)皮膚光老化，導(dǎo)致皮膚變得粗糙、皺紋加深[1]，同時老化可以限制細胞的無限制生長抑制腫瘤的發(fā)生，臨床上發(fā)現(xiàn)皮膚黑色素細胞瘤多發(fā)生于非日光暴露部位，是否紫外線在其中起了重要的作用，這其中的機制還不是十分清楚[2]。有學(xué)者認為[3]，光老化是一種癌前狀態(tài)，也有學(xué)者[4]認為細胞衰老是限制細胞發(fā)生癌變的一種保護措施。我們的研究通過紫外線照射正常人皮膚成纖維細胞誘導(dǎo)其光老化，并對成纖維細胞光老化過程中beta-catenin和c-myc兩個癌基因的變化進行了初步研究。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器:胎牛血清和高糖DMED培養(yǎng)基(Gbico公司)，0.25%胰酶-0.02%EDTA，β-gal半乳糖苷酶細胞衰老染色試劑盒(碧云天公司)，2×SDS蛋白裂解液(碧云天公司)，兔抗人β-catenin抗體，兔抗人P16抗體、兔抗人c-myc抗體(cell signaling)，辣根過氧化物酶標記羊抗兔Ig二抗(cell signaling)。Takara RT-PCR 擴增試劑盒(大連生工)。Scientz03-II紫外交聯(lián)儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人成纖維細胞的分離與培養(yǎng):我院泌尿外科兒童包皮環(huán)切術(shù)后包皮(患者知情同意)，去除皮下脂肪及血管根據(jù)文獻方法[5]，采用組織塊法分離獲得包皮成纖維細胞，高糖DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)，細胞長至90%融合后0.25%胰酶-0.02%EDTA消化傳代擴增。取第2～8代細胞進行實驗。

1.2.2 人成纖維細胞紫外線誘導(dǎo)光老化:取2～8代人成纖維細胞使用紫外交聯(lián)儀在312nm中波紫外線(UVB)下照設(shè)，UVB能量在20～40mJ/cm2范圍內(nèi)照設(shè)后48h按700個細胞/cm2重新接種于六孔板中，24h候后β-gal半乳糖苷酶細胞衰老染色試劑盒檢測細胞衰老情況。

1.2.3蛋白印跡檢測衰老人成纖維細胞中P16、β-catenin、c-myc蛋白表達變化:取2～8代人成纖維細胞按1×106個每皿接種于直徑100mm培養(yǎng)皿中，接種后24h細胞長至80%融合，在40 mJ/cm2UVB紫外線下照射，于照射后第0、12、24、48、72h收集細胞，2×SDS蛋白裂解液裂解細胞收集蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，一抗(β-catenin 1:1000，c-myc 1:200，P16 1:1000)4℃結(jié)合過夜，TBS洗滌3遍，每遍10min，加入二抗(1:2000)，室溫孵育2h，ECL試劑盒顯色，圖像分析儀掃描成像，以GAPDH為內(nèi)參進行半定量分析。

1.2.4 RT-PCR檢測衰老人成纖維細胞中β-catenin、c-myc mRNA表達變化:取2～8代人成纖維細胞按1×106個每皿接種于直徑100mm培養(yǎng)皿中，接種后24h細胞長至80%融合，在40mJ/cm2UVB紫外線下照射，于照射后第0、12、24、48、72h采用Trizol法提取細胞總RNA根據(jù)Genbank中β-catenin、c-myc和GAPDH的cDNA序列設(shè)計如下引物(上海生工公司合成)。Β-catenin(120bp)引物:5'-TGG ACT CTG GAA TCC ATT CTG-3'(F)， 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'(R)， c-myc(313bp)引物:5'-TGG ACT CTG GAA TCC ATT CTG-3'(F)， 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'(R)，GAPDH(289bp)引物:5'-TGG ACT CTG GAA TCC ATT CTG-3'(F)， 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'(R)。以GAPDH為內(nèi)參，圖像分析儀掃描成像，ImageQuant軟件半定量分析。

2實驗結(jié)果

2.1 人皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng):采用組織塊法培養(yǎng)第4天開始有細胞從組織塊邊緣爬出，第10～14天細胞長至融合，長梭形細胞中間可見鋪路石樣細胞表皮細胞，將融合細胞按1:3進行傳代，傳代后細胞生長加速第2天可融合，從第2代開始細胞呈典型的長梭形，鋪路石樣表皮細胞消失。

2.2 UVB誘導(dǎo)成纖維細胞衰老及β-gal半乳糖苷酶細胞衰老染色:UVB20～40mJ/cm2能量照射后可見細胞生長停滯呈典型衰老形態(tài)，細胞形態(tài)上變得寬大扁平，胞漿透明，胞核內(nèi)顆粒增多， (圖1①～②)。β-gal半乳糖苷酶細胞衰老染色可見典型衰老細胞核周染成藍色，對照組細胞陽性率為(18.23±3.24)%，誘導(dǎo)衰老組陽性率為(88.75±5.32)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1③。

2.3 誘導(dǎo)衰老細胞中P16蛋白的表達:UVB誘導(dǎo)衰老后第12h開始衰老相關(guān)基因P16表達增加，隨時間延長表達量也增加，至照射后24h開始P16表達明顯高于照組前細胞(見圖2)。

2.4 UVB誘導(dǎo)人皮膚成纖維細胞衰老后β-catenin、c-myc蛋白水平變化:UVB40mJ/cm2照射人皮膚成纖維細胞后從第12h開始β-catenin、c-myc蛋白表達水平分別開始降低，至照射后第72h這兩種蛋白的表達水平降至最低(見圖3)。

2.5 UVB誘導(dǎo)人皮膚成纖維細胞衰老后β-catenin、c-myc mRNA水平變化:UVB40mJ/cm2照射人皮膚成纖維細胞后β-catenin、c-myc mRNA表達水平分別從照射后第48、24h開始降低，至照射后第72h降至最低(見圖4)。

3討論

β-catenin基因位于3p21，全長40 992 bp，人類的β-catenin基因產(chǎn)物是一個相對分子質(zhì)量為88 000的蛋白質(zhì)，呈高度進化保守性，大約保留了果蠅80%的同源蛋白，與鼠的β-catenin幾乎完全同源[6]。β-catenin是Wnt通路的核心信號分子，以往研究表明[7]β-catenin基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。最近研究報道[8]在人皮膚黑色素細胞瘤中β-catenin高表達并可以抑制衰老相關(guān)基因P16的表達，使腫瘤細胞不發(fā)生衰老保持永生化狀態(tài)，β-catenin上調(diào)其下游基因c-myc、cyclinD1的表達啟動腫瘤的發(fā)生。而在β-catenin基因敲除小鼠黑色素細胞瘤中P16表達呈劑量依賴性增加[9]。在臨床上黑色素細胞瘤多發(fā)生于紫外線所照不到的地方，且在紫外線照不到的部位β-catenin基因高表達，這說明β-catenin基因的表達和降解與紫外線照射之間存在著一定的關(guān)系。

研究報道[10]Braf誘導(dǎo)的衰老在哺乳動物中是限制癌前病變的生理機制，由于紫外線照射以后Braf基因的突變刺激P16的過度表達，細胞隨后進入衰老狀態(tài)，而在日光保護部位Braf基因突變減少，P16的過度表達也不能被很好的誘導(dǎo)[11]。在非日光暴露部位β-catenin基因抑制P16的表達，使衰老延遲，但同時也增加了其發(fā)生腫瘤的機會.而日光暴露部位因為βcatenin基因表達減少，導(dǎo)致P16高表達，使衰老提前發(fā)生。我們的研究證實通過紫外線照射以后成纖維細胞形態(tài)變的寬大扁平，胞漿透明，胞核顆粒增多，呈現(xiàn)典型的衰老表現(xiàn)，衰老相關(guān)基因P16蛋白表達也增高，而β-catenin基因和其下游基因c-myc在蛋白水平和mRNA水平表達均明顯降低，且隨著衰老時間的延長其表達水平降低越明顯，這樣就顯著降低了其發(fā)生腫瘤的可能性。

在我們的研究中對紫外線誘導(dǎo)人皮膚成纖維細胞衰老的機制進行的初步研究，并發(fā)現(xiàn)β-catenin、c-myc基因在紫外線照射以后呈時間依賴性減少，為以后光療治療腫瘤提供了依據(jù)。但對紫外線照射通過何種途徑誘導(dǎo)β-catenin及其下游基因c-myc減少則沒有進行進一步的研究;而且臨床上體表皮膚腫瘤多發(fā)生于老年人這和我們的研究結(jié)果存在矛盾，這其中的機制還需要進一步研究。

[參考文獻]

[1]李春雨，張麗宏，張寧，等. 紫外線誘導(dǎo)皮膚光老化的形成機制[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2009，18(3):419-416.

[2]Yaar M，Gilchrest BA.Photoageing:mechanism，prevention and therapy[J]. Br J Dermatol，2007，157:874-887

[3]Williams M， Ouhtit A. Towards a better understanding of the molecular mechanisms involved in sunlight induced melanoma[J]. Biomed Biotechnol，2005:57-61.

[4]Dekker P，Andrea B，Van Heemst D，et al. Stress-induced responses of human skin fibroblasts in vitro reflect human longevity[J]. Aging Cell，2009，8(5):595-603.

[5]Majora M， Wittkampf T，Schuermann B，et al. Functional consequences of Mitochondrial DNA Deletions in Human Skin fibroblasts[J]. Am J Pathology，2009，175(3):1019-1030.

[6]胡孝輝，方勇. 毛囊干細胞及其增殖分化的研究進展[J].中華燒傷雜志，2009，25(2):156-158.

[7]Polakis P. more than one way to Skin a Catenin[J]. Cell，2001，105:563-566.

[8] Larue L，Delmas V. The WNT/β-catenin pathway in melanoma [J]. Biosci，2006，11:733-742.

[9]Delmas V，Beermann F，Martinozzi S，et al. β-Catenin induces immortalization of melanocytes by suppressing p16INK4a expression and cooperates with N-Ras in melanomaI development[J]. Genes Dev，2007，21:2923-2935.

[10]Li W，Sanki A，Karim RZ，et al. The role of cell cycle regulatory proteins in the pathogenesis of melanoma[J]. Pathology，2006，38:287-301.

[11]Demirkan N， Kesen Z， Akdag B，et al. The effect of the sun on expression of β-catenin， p16 and cyclin d1 proteins in melanocytic lesions[J]. Clin Exper Dermatol，2007，32:733-739.

[收稿日期]2010-01-26 [修回日期]2010-04-13

編輯/張惠娟

注:本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文