自制中藥提取物對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響

[摘要]目的:探討自制中藥提取物對人瘢痕疙瘩成纖維細胞(KFB)增殖的影響。方法:在體外培養的人KFB、正常皮膚成纖維細胞(NFB)培養液中加入不同濃度的自制中藥水提物、醇提物，采用倒置顯微鏡、CCK-8試劑盒及生化分析儀對成纖維細胞的形態、增殖活性、生長狀況及乳酸脫氫酶(LDH)活性進行觀察與測定。結果:在一定濃度中藥提取物的作用下，KFB形態發生改變，增殖活性降低，LDH活性增高;其中醇提物抑制KFB增殖較水提物更有效，KFB對中藥的抑制反應比NFB更敏感。結論:自制中藥可能通過抑制KFB增殖、細胞毒性作用等而發揮治療瘢痕疙瘩的作用。

[關鍵詞]瘢痕疙瘩;中醫藥;成纖維細胞

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)05-0701-03

Effects of extractant from self-made traditional Chinese drug on proliferation of keloid-derived fibroblasts

ZHAO Qing-li，MENG Ru-song，YANG Qing-qi，CAI Rui-kang

(Department of Dermatology，Air Force General Hospital of Chinese PLA，Beijing 100036，China)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of the extractant from the self-made traditional Chinese drug on the proliferation of keloid-derived fibroblasts (KFB).MethodsKFB and normal fibroblasts (NFB) were cultured in vitro. The aqueous or alcohol extractant in various concentr ation from the self-made traditional Chinese drug was added to the culture media. Inverted microscope， CCK-8 and biochemistry analysator were applied to observe or detect fibroblasts appearance， proliferation， growth and lactate dehydrogenase (LDH) activity.ResultsWithin certain concentration， after the extractant from drug taking action， KFB appearance was altered， the proliferative activity was decreased， the LDH activity was increased. In addition， the alcohol extractant inhibited the proliferation of KFB more efficiently than the aqueous extractant，KFB were more sensitive to drug than NFB. Conclusions The self-made traditional Chinese drug may produce a therapeutic effect by inhibiting the proliferation of KFB，cytotoxicity，etc.

Key words:keloid， traditional Chinese drug， fibroblast

我們將全蝎等六味中藥配制成軟膏外用瘢痕疙瘩皮損處，經采用隨機、對照試驗方法進行臨床觀察，獲得比較滿意的結果(待發表)。本研究檢測自制中藥提取物對體外培養的瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響，旨在為瘢痕疙瘩臨床治療提供實驗依據。

1材料和方法

1.1 實驗材料:自制中藥由全蝎、蚤休、丹參、生乳香、浙貝母、生甘草組成，其水提物、醇提物由中國中醫科學院廣安門醫院制劑中心陳賢春藥師制備。體外培養的人瘢痕疙瘩成纖維細胞(Keloid Fibroblasts， KFB)6株、人正常皮膚成纖維細胞(Normal Fibroblasts， NFB)3株由中國醫學科學院整形外科醫院王春梅教授贈送。主要試劑及儀器包括CCK-8試劑盒(碧云天生物技術研究所)、倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)、酶標閱讀儀(450型 美國BIO-RAD)、全自動生化分析儀(日本 日立)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物的配制:稱取適量的自制中藥水提物細粉加PBS溶解，高壓滅菌;量取適量的醇提物液水浴蒸干，加二甲基亞砜及PBS溶解，微孔濾膜濾過除菌。水提物、醇提物均用細胞培養液(含DMEM、新鮮小牛血清、青霉素、鏈霉素)倍比稀釋為31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000、8 000、6 000μg/ml。

1.2.2 成纖維細胞形態學觀察及增殖活性的測定:人KFB、NFB傳代3～7代，加0.25%胰蛋白酶消化，制成5×104/ml細胞懸液，以100μl/孔(5×103細胞/孔)加入96孔板，培養箱中孵育48h。吸除原培養液，中藥組KFB、NFB孔中分別加入31.25～16000μg/ml間10個濃度的中藥水提物、醇提物培養液100μl/孔，陰性對照組KFB、NFB孔中加入培養液100μl/孔，每組均設3個復孔，培養箱中繼續孵育48h。倒置顯微鏡下觀察細胞形態并攝像。向各培養孔中加入CCK-8溶液10μl，培養箱中作用1h，在酶標儀上測定450nm處光密度值(OD值)。抑制率(%)=陰性對照OD值-中藥組OD值/陰性對照OD值。

1.2.3 成纖維細胞生長狀況的測定:根據增殖實驗結果，設定抑制率為50%左右的自制中藥醇提物濃度為本實驗濃度。細胞接種同前。中藥組KFB、NFB孔中加入2000μg/ml中藥醇提物培養液100μl/孔，陰性對照組KFB、NFB孔中加入培養液100μl/孔，每組均設3個復孔，于培養箱中孵育24h、48h、72h、96h、120h時取出培養板，在相應孔中加入CCK-8溶液10μl，培養箱中作用1h，在酶標儀上測定450nm處OD值，將在各時間點測得的OD值繪制出生長曲線。

1.2.4 乳酸脫氫酶(LDH)活性測定:KFB、NFB以2ml/孔(3×105細胞/孔)接種于6孔板中，方法同前。中藥組KFB孔中分別加入31.25～16 000μg/ml間6個濃度的中藥醇提物培養液2ml/孔，NFB孔中加入500μg/ml中藥醇提物培養液2ml/孔，培養箱中繼續孵育48h。收集上清，用全自動生化分析儀測定LDH活性。

1.3 統計學分析:將所有資料輸入數據庫，采用SPSS 13.0統計軟件進行統計處理，檢測指標用x±s、率表示，統計分析方法為t檢驗。P<0.05定義為差異有統計學意義。

2結果

2.1 藥物對成纖維細胞形態的影響:倒置顯微鏡下可見陰性對照組人KFB、NFB貼壁生長，形態狹長，多平行排列。在自制中藥水提物、醇提物16000μg/ml作用下，KFB、NFB全部裂解成碎片;在4000～8000μg/ml作用下，部分細胞碎裂，部分貼壁生長，形態短粗，部分呈圓形漂浮于培養液中;在1000～2000μg/ml作用下，部分短粗細胞貼壁生長，部分為圓形漂浮細胞，并呈濃度依賴性，無碎裂細胞;在31.25～500μg/ml濃度下，細胞以狹長貼壁生長為主，見少數短粗貼壁細胞及圓形漂浮細胞，對濃度依賴性不明顯。藥物各個濃度水提物與醇提物間比較，KFB與NFB間比較，碎裂細胞、短粗貼壁細胞、圓形漂浮細胞無鏡下可見的差異(圖1)。

2.2 藥物對成纖維細胞增殖活性的影響:自制中藥水提物在2 000～1 6000μg/ml、醇提物在1 000～1 6000μg/ml對KFB增殖具有抑制作用，水提物及醇提物在4 000～16 000μg/ml對NFB增殖具有抑制作用，與陰性對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。醇提物在31.25～16 000μg/ml對KFB、NFB增殖呈濃度依賴性抑制;水提物在≤2 000μg/ml對KFB、NFB增殖的抑制率驟然降低，在31.25～62.5μg/ml對NFB增殖有促進作用(表1～2)。

2.3 藥物對成纖維細胞生長狀況的影響:從生長曲線中可見，陰性對照組KFB、NFB數量隨時間的延長而增多，至96h細胞數達高峰，至120h細胞數稍減少。2 000μg/ml自制中藥醇提物作用24h后，KFB、NFB數量均減少;隨著時間的延長，NFB數量逐漸增多，呈現出細胞數量稍少于陰性對照組的持續生長狀態;在24～120h間 5個時間點，KFB數量均顯著減少， 呈現出持續地被明顯抑制狀態(圖2)。

2.4 藥物的細胞毒性作用:KFB在2 000～16 000μg/ml自制中藥醇提物的作用下，培養液上清中LDH活性增高，與陰性對照組比較差異均有統計學意義(P<0.001);KFB在31.25～500μg/ml、NFB在500μg/ml作用下(t=0.240， P =0.822)，培養液上清中LDH活性與陰性對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)。

3討論

以往的研究表明，瘢痕疙瘩的發生與成纖維細胞生物學功能異常有關，主要表現為成纖維細胞活性增高及耐受性增強;KFB在離體時可繼續產生高水平的膠原蛋白、纖維粘連蛋白、彈力蛋白、蛋白多糖等細胞外基質，在低濃度血清生長因子培養液中仍能持續生長[1]。藉此，檢測藥物作用后體外培養的KFB增殖性能，已成為多數學者探討瘢痕疙瘩治療藥物作用機制的基本手段[2]。近年來，關于中藥對KFB生物性狀的影響已引起國內學者的重視，但所測定的中藥多為單味藥提取物或活性成分，關于復合中藥的實驗室研究為數有限[3-4]。

成纖維細胞是貼壁生長細胞，其形態并不固定，當培養條件發生改變、自身生理功能出現變化時容易在形態方面表現出來[5]。Aggeler等[6]認為，凡是能導致成纖維細胞變圓的試劑或條件，都能增加其膠原酶的合成。我們在倒置顯微鏡下觀察到，當自制中藥水提物、醇提物在濃度31.25～8000μg/ml范圍內，KFB、NFB均有不同程度的細胞形態改變，這說明藥物影響著成纖維細胞的正常生理功能，可能包括增加膠原酶的合成。

本研究的成纖維細胞增殖活性的測定結果顯示，自制中藥醇提物對KFB增殖的抑制濃度偏低，對KFB、NFB增殖的抑制呈濃度依賴性，而水提物的抑制濃度偏高，在較低濃度時其抑制作用明顯降低，甚至有促進增殖作用。因此，我們認為自制中藥醇提物對成纖維細胞增殖的抑制作用較水提物更有效，這可能與醇提法能更多地提取中藥的有效成分有關，故在后續實驗中我們僅采用醇提物進行檢測。將成纖維細胞增殖活性測定與生長狀況測定結果結合起來分析，我們發現KFB在中藥醇提物、水提物作用下其增殖均被抑制，且藥物濃度偏低，而NFB增殖的藥物抑制濃度偏高，且對31.25～62.5μg/ml水提物的刺激呈現出增殖增強反應;在2 000μg/ml中藥醇提物作用120h時，KFB增殖顯現出持續地被明顯抑制狀態，而NFB增殖雖亦被抑制，但細胞增殖仍顯現出逐漸增加的趨勢。因此，我們認為自制中藥具有較強的針對性，對KFB增殖的抑制作用更明顯，即KFB對自制中藥抑制的反應比NFB更敏感。

本研究還發現，當自制中藥醇提物≥2000μg/ml濃度時，KFB培養液中LDH活性顯著增加，這表明存在有細胞膜受損、LDH外釋的現象，這提示我們本藥物有可能是通過殺傷、破壞KFB而發揮作用的[7]，同時也提醒我們盲目地增加本藥物的濃度并不安全。

[參考文獻]

[1]陳海蓉，吳延芳.瘢痕疙瘩成纖維細胞研究進展[J].中國麻風皮膚病雜志，2004，20(5):465-466.

[2]陳洪，農曉琳.皮膚病理性瘢痕的基礎理論研究與進展[J].中國組織工程研究與臨床康復， 2008，12(42):8358-8361.

[3]蔣文波，金兵，戴昭秋，等.中藥對瘢痕疙瘩成纖維細胞抑制作用的研究進展[J].中醫藥學導，2006，34(5):55-56.

[4]林序文，吳浩俊，張培華.中藥有效成分治療病理性瘢痕研究進展[J].現代中西醫結合雜志，2007，16(26):3920-3922.

[5]司徒鎮強，吳軍正.細胞培養[M].北京:世界圖書出版社公司，2001:6-85.

[6]Aggeler J， Frisch SM， Werb I. Changes in cell shape correlate whit collagenase gene expression in rabbit synovial fibroblasts[J]. J Cell Biol，1984，98(5):1662-1671.

[7]陳明春，黃茂芳.積雪草甙和苦參堿對皮膚瘢痕成纖維細胞生長及膠原合成影響的研究[J].中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2006，5(1):11-14.

[收稿日期]2010-02-22 [修回日期]2010-04-10

編輯/張惠娟

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