肝移植受者服用FK506期間T淋巴細(xì)胞亞群\\NK\\CIK細(xì)胞的分析

[摘要] 目的 分析肝移植受者服用FK506期間外周血T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及CIK細(xì)胞的變化，探討其在移植排異監(jiān)測(cè)中的作用。方法 采用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)技術(shù)對(duì)17例服用FK506的肝移植受者及25例健康對(duì)照者進(jìn)行外周血的K506QIJIANT淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及CIK細(xì)胞檢測(cè)，然后以健康體檢者為對(duì)照進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。FK506血藥濃度的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定。結(jié)果 肝移植受者術(shù)后3個(gè)月組的T淋巴細(xì)胞亞群CD3值高于健康對(duì)照組(Tamhane T2法P=0.004)，術(shù)后1個(gè)月組的T淋巴細(xì)胞亞群CD4值高于健康對(duì)照組(Tamhane T2法P=0.040)，術(shù)后2周組、術(shù)后1個(gè)月組、術(shù)后3個(gè)月組的NK值均低于健康對(duì)照組(LSD-t檢驗(yàn)P≤0.023)，術(shù)后1個(gè)月組的CIK值低于健康對(duì)照組(Tamhane T2法P=0.005)。結(jié)論 肝移植受者在服用FK506期間，外周血中T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、CIK細(xì)胞可作為移植排異反應(yīng)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。當(dāng)FK506血藥濃度恒定時(shí)，可使T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、CIK細(xì)胞的值保持在正常水平。

[關(guān)鍵詞] 肝移植; T淋巴細(xì)胞亞群; NK細(xì)胞; CIK細(xì)胞; FK506

[中圖分類(lèi)號(hào)] R657.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2010)01-01-03

Peripheral Blood T-lymphocyte Subsets，NK and CIK in Liver Transplant Recipients Taking FK506

QIN Wen HU Dachun TAN Jianling

Department of Laboratory，Kunming Municipal First People’s Hospital，Kunming 650011，China

[Abstract] ObjectiveTo analyze the changes of T-lymphocyte subsets，NK and CIK of the peripheral blood in liver transplant recipients during their taking of FK506，and to explore its function in monitoring allograft rejection. MethodsFlow cytometry(FCM)was used to determine the changes of the peripheral blood T-lymphocyte subsets，NK and CIK of 17 liver transplant recipients during their taking of FK506 and 25healthy controls. The blood concentration of FK506 was measured by enzyme immunoassay technique. ResultsThe CD3 value of the liver transplant group was higher at 3 months after liver transplant operation than that in healthy control group(Tamhane T2 method P=0.004)，the CD4 value of the liver transplant group was higher at one month after that than that in healthy control group(Tamhane T2 law P=0.040)，the NK mean value of the liver transplant group was lower at two weeks，a month and 3 months after liver transplant operation than that in the healthy control group(LSD-t test P≤0.023)，and the CIK of the liver transplant group was lower at one month after that than that in the healthy control group(Tamhane T2 method P=0.005). ConclusionThe T-lymphocyte subsets，NK and CIK of the peripheral blood in liver transplant recipients during their taking of FK506 can act as monitoring indicators of allograft rejection，and when the blood concentration of FK506 is constant，it will enable T-lymphocyte subsets，NK and CIK to maintain at normal levels.

[Key words]Liver transplantation; T-lymphocyte subsets; NK; CIK; FK506

器官移植已經(jīng)成為治療終末期器官衰竭的有效手段，但移植排異反應(yīng)是影響移植受者存活的重要原因。目前控制排異反應(yīng)較為有效的手段是使用免疫抑制劑。他克莫司又名普樂(lè)可復(fù)(即FK506)[1]，是一種具有強(qiáng)大免疫抑制作用的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)免疫抑制劑，它能抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CN)，使活化T細(xì)胞核因子(NFAT)及其他核因子不能脫磷酸而向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，從而阻斷白細(xì)胞介素(IL-2)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生及T細(xì)胞的活化和增殖[2]。FK506現(xiàn)已成功應(yīng)用于心臟、肝臟和腎臟等實(shí)體器官移植，尤使用于肝移植。但肝移植受者在服用FK506后的免疫細(xì)胞變化情況如何目前此方面的報(bào)道還不多。現(xiàn)即為對(duì)昆明市第一人民醫(yī)院17例肝移植受者服用FK506后不同時(shí)期外周血中淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及CIK細(xì)胞的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，旨在為臨床監(jiān)測(cè)移植排異反應(yīng)的發(fā)生提供客觀(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

接受FK506治療的肝移植受者組，為2008年1月～2009年1月在昆明市第一人民醫(yī)院接受同種異體肝移植的受者，共17例，其中男性15例，女性2例，年齡29～73歲，術(shù)后檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)明顯的宿主抗移植物排斥反應(yīng)或移植物抗宿主免疫反應(yīng)的臨床表現(xiàn)。健康對(duì)照組為該醫(yī)院的25例健康體檢者，均無(wú)相關(guān)疾病，且未使用免疫抑制劑和相關(guān)免疫調(diào)節(jié)藥物，其中男性11例，女性14例，年齡20～65歲。

1.2 儀器與試劑

儀器采用FC-500流式細(xì)胞儀及ASCENT全自動(dòng)酶標(biāo)儀。其中流式分析試劑1(CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5)及試劑2(CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-PC5)為Beckman- Culter公司產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫試劑為他克莫司定量檢測(cè)試劑盒，產(chǎn)于美國(guó)Diasorin公司。

1.3 方法

采用流式細(xì)胞儀分析外周血中T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及CIK細(xì)胞的變化。于肝移植受者術(shù)后2周、1個(gè)月、3個(gè)月分別抽取外周血2mL，用肝素抗凝。將試劑1、2分別加入到2根流式管的管底，各加10μL，再加入抗凝全血標(biāo)本100μL，室溫避光孵育20min，然后加入NH4CL溶血?jiǎng)?mL，室溫避光孵育20min，待流式細(xì)胞儀穩(wěn)定后即可上機(jī)檢測(cè)。其中試劑1標(biāo)記的標(biāo)本調(diào)用NEW-CD4-CD8-CD3-CD45方案進(jìn)行檢測(cè)，試劑2標(biāo)記的標(biāo)本則調(diào)用NEW-CD56-CD19-CD3-CD45方案。讀取結(jié)果時(shí)，CD3+細(xì)胞代表T細(xì)胞;CD3+/CD4+/CD8-代表TH細(xì)胞(CD4);CD3+/ CD4-/CD8+代表TS細(xì)胞(CD8);CD3-CD56+代表NK細(xì)胞;CD3+/ CD56+代表CIK細(xì)胞。FK506血藥濃度的測(cè)定，取肝移植受者抗凝血2mL采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(χ±s)表示;對(duì)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的多組樣本均數(shù)比較，采用單因素方差分析(One-way ANOVA);當(dāng)各總體方差齊時(shí)，用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)

行多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較;當(dāng)各總體方差不齊時(shí)，用Tamhane T2法進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較。

2 結(jié)果

17例肝移植受者服用FK506后不同時(shí)期及25例健康對(duì)照者外周血T淋巴細(xì)胞亞群、NK、CIK細(xì)胞及FK506血藥濃度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1可見(jiàn)，F(xiàn)K506血藥濃度在不同時(shí)期的檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.676，P=0.090)，CD4/CD8測(cè)定值在服用FK506后不同時(shí)期的檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.233，P=0.308)，而CD3、CD4、CD8、NK、CIK測(cè)定值的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較，術(shù)后3個(gè)月組的CD3值高于健康對(duì)照組(Tamhane T2法P=0.004)，術(shù)后1個(gè)月組的CD4值高于健康對(duì)照組(Tamhane T2法P=0.040)，術(shù)后2周組、術(shù)后1個(gè)月組、術(shù)后3個(gè)月組的NK值均低于健康對(duì)照組(LSD-t檢驗(yàn)P≤0.023)，術(shù)后1個(gè)月組的CIK值低于健康對(duì)照組(Tamhane T2法P=0.005)。其余兩兩之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD-t檢驗(yàn)或Tamhane T2法P>0.05)。

3 討論

3.1 FK506的變化

FK506是日本藤澤公司從放線(xiàn)菌屬筑波鏈真霉菌NO1993中提取的一種代謝藥物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬23元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)免疫抑制劑。FK506不僅抑制TcR、CD3復(fù)合體介導(dǎo)的T細(xì)胞活化，也可抑制其他細(xì)胞表面分子的活化。其作用機(jī)制是FK506能抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CN)，使活化T細(xì)胞核因子(NFAT)及其他核因子不能脫磷酸而向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，從而阻斷白細(xì)胞介素(IL-2)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生及T細(xì)胞的活化和增殖。從而使T細(xì)胞亞群的失衡得到明顯改善，CD4+T細(xì)胞表達(dá)降低，CD8+T細(xì)胞表達(dá)回升，CD4/CD8比值降低，且均恢復(fù)到正常水平[3]。本文結(jié)果中顯示FK506在術(shù)后各個(gè)階段的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在監(jiān)測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群、NK及CIK細(xì)胞期間，肝移植受者血液中FK506的血藥濃度保持相對(duì)穩(wěn)定。

3.2 T淋巴細(xì)胞亞群的變化

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)功能最重要的一大細(xì)胞群。其中CD4細(xì)胞是輔助T細(xì)胞，在免疫反應(yīng)中是主要反應(yīng)細(xì)胞，主要功能是通過(guò)其分泌的淋巴因子，增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答過(guò)程，輔助誘導(dǎo)其他免疫細(xì)胞如殺傷性T細(xì)胞、B細(xì)胞等共同發(fā)揮免疫作用。CD4細(xì)胞的減少可導(dǎo)致免疫功能低下。在移植免疫反應(yīng)中，CD4+T細(xì)胞與移植排斥反應(yīng)密切相關(guān)，已有資料[4]表明CD4+TH1細(xì)胞主要參與急性排斥反應(yīng)，而CD4+TH2細(xì)胞則主要參與慢性排斥反應(yīng)。CD8細(xì)胞是細(xì)胞毒T細(xì)胞，在移植排斥反應(yīng)中除具有對(duì)靶細(xì)胞攻擊殺傷的細(xì)胞毒作用外，同時(shí)對(duì)CD4細(xì)胞還具有調(diào)節(jié)性抑制作用，CD8細(xì)胞的降低可見(jiàn)于自身免疫性疾病或變態(tài)反應(yīng)性疾病。而CD4/CD8比值是重要的免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，其比例的降低與免疫系統(tǒng)損害的程度相關(guān)[5]。CD4/CD8比值升高提示機(jī)體免疫功能相對(duì)活躍，當(dāng)監(jiān)測(cè)器官移植排斥反應(yīng)時(shí)，CD4/CD8比值升高預(yù)示可能發(fā)生排異反應(yīng)[6]。T淋巴細(xì)胞在誘導(dǎo)肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)及誘導(dǎo)肝移植免疫耐受方面有著十分重要的作用。有研究[7]表明在急性排斥反應(yīng)臨床癥狀出現(xiàn)前1～5d，T細(xì)胞總數(shù)和CD4/CD8比值均升高。本文中結(jié)果顯示，術(shù)后3個(gè)月組的CD3值與術(shù)后一個(gè)月組的CD4值高于健康對(duì)照組，且服藥后不同時(shí)期的均值都較健康對(duì)照組有升高趨勢(shì)，提示移植后在一定時(shí)間內(nèi)機(jī)體對(duì)移植物可能存在一定的排異反應(yīng)。但本研究中CD4/CD8比值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，只是在3個(gè)月時(shí)均值有少許減低，提示肝移植受者對(duì)移植物雖然有一定的排異作用，但免疫抑制劑的應(yīng)用能使這種排異得到有效的控制，且保持相對(duì)穩(wěn)定。再次證明T淋巴細(xì)胞亞群可作為較好的移植排異反應(yīng)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，但T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)移植排異反應(yīng)的臨床價(jià)值還待加大樣本量做進(jìn)一步的研究。

3.3 NK細(xì)胞的變化

NK細(xì)胞是機(jī)體天然免疫的主要承擔(dān)者，是獲得性細(xì)胞免疫的核心調(diào)節(jié)細(xì)胞，同時(shí)也是造血的主要調(diào)控成分，在抗感染和抗腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。NK細(xì)胞在移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)明顯升高，其被觸發(fā)的第一反應(yīng)是迅速分泌大量的細(xì)胞因子(IFN-r、TNF-a等)，但由于免疫抑制劑FK506對(duì)細(xì)胞因子的阻斷作用，進(jìn)而影響了受者機(jī)體殺傷細(xì)胞的活性。本文結(jié)果顯示，肝移植受者術(shù)后2周組、1個(gè)月組、3個(gè)月組的NK值均低于健康對(duì)照組，提示FK506治療有效，減低了NK細(xì)胞的活性。且從表中可以看出不同時(shí)期的NK細(xì)胞值均減低，提示FK506對(duì)細(xì)胞因子的抑制作用可能較抑制T淋巴細(xì)胞亞群的活化和增殖作用更有效。但本文統(tǒng)計(jì)例數(shù)相對(duì)較少，F(xiàn)K506是否對(duì)NK細(xì)胞有更大的調(diào)節(jié)作用還待加大樣本量進(jìn)一步研究。

3.4 CIK細(xì)胞的變化

CIK細(xì)胞是一類(lèi)非主要組織相容性復(fù)合物和非T細(xì)胞受體限制性的免疫活性細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞為CD3+CD56+，具有NK細(xì)胞一樣的殺瘤作用，且據(jù)報(bào)道CIK細(xì)胞在惡性腫瘤患者外周血中的高水平較NK細(xì)胞更明顯，并且不受惡性腫瘤細(xì)胞類(lèi)型的影響。本文結(jié)果提示，術(shù)后一個(gè)月組的CIK值低于健康對(duì)照組，其他組的均值也顯示降低趨勢(shì)，提示FK506可能同樣對(duì)CIK發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。目前，CIK主要應(yīng)用于腫瘤患者的研究，至于在肝移植術(shù)后的變化及FK506是否對(duì)CIK具有調(diào)節(jié)作用還待今后通過(guò)做動(dòng)物試驗(yàn)作進(jìn)一步的研究。

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(收稿日期:2009-08-15)