局部轉染CTLA-4Ig抑制大鼠異體復合組織移植急性排斥反應的研究

[摘要]目的:觀察腺病毒介導融合基因細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4Ig)局部轉染大鼠同種異體移植的復合組織對急性排斥反應的抑制作用。方法:以近交系Brown Norway大鼠為供體，Lewis大鼠為受體，采用腹部游離皮瓣作為異體復合組織移植(composite tissue allotransplantation，CTA)模型。將受者分為3組，A組(空白對照組):異體皮瓣離體保存時不感染腺病毒，只灌注PBS溶液;B組(陰性對照組):異體皮瓣離體保存時灌注攜帶增強型綠色熒光蛋白的重組腺病毒(Ad-EGFP);C組(基因治療組):異體皮瓣離體保存時灌注AdCTLA-4Ig。術后觀察各組移植皮瓣的排斥情況及存活天數，進行組織病理學檢查，并觀察CTLA-4Ig在移植組織中的表達情況及對急性排斥反應的抑制作用。結果:①A組、B組皮瓣移植物平均生存時間分別為(7.8±1.5)天和(7.1±1.6)天，C組移植皮瓣平均存活時間為(10.4±2.3)天，C組存活期長于A組和B組，差異有統計學意義(P<0.01);②移植皮瓣病理學檢查:術后第7天，A組與B組移植皮瓣均發生嚴重急性排斥反應，而C組排斥反應較A組和B組輕微，但C組術后第11天也表現出嚴重急性排斥反應;③移植前后血清白細胞介素2(interleukin-2， IL-2)水平:各組移植術后早期發生急性排斥反應時，IL-2均有明顯升高，但實驗組血清IL-2水平在第3天、第7天時均明顯低于兩對照組(P<0.01)。結論:建立了一種新的異體復合組織移植局部基因轉染模型，皮瓣灌注AdCTLA-4Ig能獲得融合基因在移植復合組織中的表達，局部產生的CTLA-4Ig能抑制急性排斥反應的發生，延長移植物存活時間。

[關鍵詞]同種異體復合組織移植;CTLA-4Ig;基因治療;急性排斥反應

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)01-0068-04

Local gene transfer of CTLA-4Ig to inhibit the acute rejection of composite tissue

allograft in rats

ZHAO Ke-feng，PAN Hua，XIAO Bo，LI Yang，GUO Shu-zhong

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of gene transfer of CTLA-4Ig delivered by adenovirus to inhibit the acute rejection of composite tissue allograft (CTA) in rat.MethodsThe epigastric flaps from Brown Norway rats were transplanted into Lewis recipients to set up CTA model. 30 couples of rats were randomly devided into 3 groups: Group A， n=10， control， without treatment. Donor flap' femoral artery was perfused ex vivo after harvest with PBS solution containing no adenovirus. Group B， n=10， AdEGFP was perfused into donor flap via femoral artery after flap harvest. Group C， n=10， treated with AdCTLA-4Ig. Observe the survive ratio of animal and rejection time of composite tissue flap， histologic outcomes， and the level of IL-2 of blood serum to evaluate the inhibition to acute rejection.ResultsThe average survival times of flap grafts in group A and group B were (7.8 ± 1.5) days and (7.1 ± 1.6) days. In contrast， the survival time of group C was (10.4±2.3)days， which was longer than group A and group B， the difference was statistically significant(P<0.01). Histologic outcomes and the level of IL-2 were coincident with the acute rejection observed outside the flap.ConclusionUsing ex vivo gene transfer technique， CTLA-4Ig gene can be introduced to the flap graft during physiological temperature preservation. The modified graft can express and excrete CTLA-4Ig locally， which can suppress acute alloimmune response and is responsible for prolongation of graft survival.

Key words: composite tissue allotransplantation; CTLA-4Ig; gene therapy; acute rejection

采用高效轉染載體將免疫調節基因導入移植物，既可維持局部的免疫抑制，又可減少對全身的副作用，可能為臨床治療排斥反應、延長移植物存活及誘導移植免疫耐受提供一條新的思路。研究表明，阻斷共刺激信號途徑可抑制免疫排斥反應。CTLA-4Ig可有效阻斷B7-CD28 信號通路，從而抑制T細胞活化，延長移植物存活[1]。本實驗利用復合組織可在體外較長時間耐缺氧的能力，在移植物離體保存期間，經供養動脈灌注，將AdCTLA-4Ig轉染大鼠下腹部游離皮瓣，并建立大鼠同種異體復合組織移植模型，探討局部轉染該基因對同種異體復合組織移植急性排斥反應的影響及機制。

1材料和方法

1.1 實驗動物:供者為Brown Norway(BN，RT1n)大鼠，受者為Lewis(RT11)大鼠。供、受者均為近交系健康大鼠，雄性，體重200～300g，均購自北京維通利華實驗動物有限公司，并由第四軍醫大學實驗動物中心按SPF級條件進行飼養。

1.2 重組腺病毒:AdCTLA-4Ig為攜帶人CTLA-4Ig基因的5型非增殖型腺病毒，滴度為4×109蝕斑形成單位(PFU)/ml;對照病毒AdEGFP為EGFP基因的5型非增殖型腺病毒，滴度為4×109 PFU/ml。均由上海醫元生物基因科技發展有限公司提供。

1.3 實驗分組:實驗隨機分為三組，每組10只。A組(空白對照組)供瓣離體期間以PBS溶液灌注;B組(陰性對照組)供瓣離體保存時灌注攜帶EGFP基因的重組腺病毒AdEGFP 1×109 PFU;C組(AdCTLA-4Ig轉染組)供瓣離體保存時灌注攜帶CTLA-4Ig基因的重組腺病毒AdEGFP 1×109 PFU。

1.4 同種異體復合組織移植模型的建立:本實驗以Brown Norway大鼠為供體，Lewis大鼠為受體，以股動、靜脈為蒂進行同種異體腹部游離皮瓣移植，作為復合組織移植的模型。1%戊巴比妥鈉(產自佛山市實驗化工廠)按50mg/kg腹腔注射麻醉成功后，在腹股溝處找到股動脈搏動點，在其上方設計一大小3cm×2.5cm腹部皮瓣。沿腹肌肌膜表面小心切開皮瓣，可見皮瓣由皮膚和其下的肉膜組成。分離出腹壁淺動靜脈和股動靜脈，結扎并剪斷股動靜脈肌穿支。皮瓣游離。

經股動脈斷端插管，并以6-0絲線結扎固定，通過1ml注射器和微量推注泵先向皮瓣內灌注1ml PBS溶液，直至皮瓣靜脈流出液無色，以沖出殘留血液。隨后在120mmHg的壓力下向其中灌注病毒液1×109 PFU，灌注完畢后以顯微血管夾夾閉股動脈及股靜脈，皮瓣浸于PBS緩沖液，37℃孵箱中4h后，打開血管夾。解剖受體股動靜脈，供、受體股動靜脈端端吻合，縫合肉膜、皮膚。手術完成。手術當天及術后3日內肌注青霉素鈉50 000U/kg，2次/日。

1.5 大體標本的觀察:術后定期觀察各組移植皮瓣存活情況及急性排斥反應發生過程、排斥反應外觀的輕重程度以及皮瓣存活時間，以此評價局部轉染AdCTLA-4Ig對急性排斥反應的抑制作用。

1.6 組織病理學檢查:分別在術后第3、5、7、11天，采集異體皮瓣皮膚標本進行病理學檢查，評估排斥反應的程度。樣本應用10%福爾馬林固定，然后儲存于70%的酒精中，切片，應用HE染色，進行病理學分析。病理學分析對象包括組織結構、血管周圍炎、毛囊周圍炎、真皮炎癥和表皮變性程度等發生情況。

1.7 ELISA法測定血清中IL-2水平:各組皮瓣存活受者于移植術前和移植后第3、7、11天經斷尾取血1ml，采集的血液置37℃水浴1h，3 000r/min離心20min后，收集上清，分裝3～4管，-80℃保存。采用定性雙抗體夾心法，按IL-2 ELISA試劑盒(RD Systems，Inc)說明書的步驟測定血清中IL-2的水平。

1.8 統計學分析:在統計教研室的指導下，應用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析。各組所得數據用均數±標準差表示，進行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1異體皮瓣的排異情況與皮瓣存活時間:術后A組1例，C組2例發生血栓，導致皮瓣死亡，并經血管探查確診;B組1例病例取材時發生麻醉意外，搶救無效死亡;A組1例飼養時異體皮瓣被大鼠咬脫。以上均從實驗中剔除。其余各組皮瓣均完全存活而無缺血性壞死區。各組有效例數如表1。

各組動物異體皮瓣分別在術后不同時間出現了急性排斥反應，大體表現為:皮膚質地逐漸腫脹、變硬，局部皮溫升高，隨后部分區域表面潰爛并出現脫毛等癥狀，而后出現深紅色斑塊，逐漸變為紫黑色，最后整個皮瓣變黑壞死。為方便實驗分析和統計學處理，本實驗以整個皮瓣變黑、病理學顯示為重度排異者為皮瓣存活時間。各實驗組皮瓣的存活時間如表1。C組存活期明顯長于A組和B組，差異均具有統計學意義(P<0.01)。

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2.2 病理學檢查結果:A組與B組組織病理學表現無明顯差異，術后3天可見白細胞增多，以淋巴細胞增多為主，伴單核細胞浸潤，炎細胞多圍繞在血管及毛囊周圍，真皮層水腫明顯;術后第7天真皮水腫減輕，而淋巴細胞浸潤增多，出現典型的血管炎和毛囊炎，多處表皮分離，結構模糊甚至脫落消失。C組術后3天表現與A、B組無明顯差異，可見白細胞浸潤及真皮層水腫;術后7天示真皮水腫減輕，少量淋巴細胞浸潤，出現輕微血管炎及毛囊炎，但皮瓣組織結構清晰，無明顯損傷;術后11天病理學檢查示淋巴細胞浸潤增多，以單核細胞為主，并出現較典型毛囊炎與血管炎，真皮水腫增厚，表皮分離，組織結構模糊。

2.3 各組大鼠血清IL-2表達的比較:各組移植前后血液IL-2水平見表2。移植術前各組間比較，差異無統計學意義(P均>0.05)，A、B組術后第3、7天血清IL-2水平均高于C組，差異具有顯著統計學意義(P均<0.01)，而A、B兩組間無統計學差異(P>0.05)。分析表2，并和表1對比，可以看出移植后各組IL-2的水平明顯升高，并與排異反應的程度相關，如A、B組術后第7天皮瓣排異反應發生后，IL-2的水平顯著升高。C組皮瓣灌注AdCTLA-4Ig進行局部基因轉染后，可以使IL-2顯著上升的時間推后，異體皮瓣的存活時間延長，但是皮瓣局部灌注AdCTLA-4Ig不能有效地控制排異反應，IL-2的水平也會顯著增加，最終由于全身排異反應的不斷增強，皮瓣發生排異反應而死亡。

3討論

同種異體復合組織移植(CTA)臨床應用已經初步獲得成功，顯示了其在體表組織器官缺損修復中良好的應用前景[2]。由于包含抗原性較強的皮膚組織，異體復合組織移植較心、肝等實體器官移植更容易發生排斥反應，特別是術后早期階段，需要全身使用大劑量免疫抑制藥物抑制急性排斥反應，而這些藥物具有較多的毒副作用，如肝腎及其他臟器損害、糖尿病等，受者甚至面臨發生致死性感染和腫瘤的危險[2]。第一例異體顏面復合組織移植的患者術后出現了腎功能損傷[3]，第二例顏面復合組織移植的患者出現了高血糖癥[4]。這些副作用是影響復合組織移植在臨床上推廣應用的主要原因。因此，如何抑制術后早期急性排斥反應，降低全身免疫抑制藥物的應用劑量是目前亟需解決的問題。

CTLA-4作為免疫抑制及誘導免疫耐受的基因治療靶分子近年來備受學者們的關注。通過基因重組，將CTLA-4分子胞外功能區與免疫球蛋白IgG恒定區相結合，形成融合蛋白CTLA-4Ig ，其與B7分子具有高度的親和力，可以和CD28競爭結合抗原提呈細胞(APC)上的B7家族分子，阻斷CD28與B7的信號傳導通路，抑制T細胞活化所需的第二信號的產生，導致T細胞的免疫失能，誘導對特異性抗原的免疫耐受[5]。人和鼠的CTLA-4基因高度同源，人CTLA-4也可與大鼠B7分子結合，阻斷其第二信號途徑[6]。CTLA-4Ig在血漿中的半衰期只有30h，需要反復給藥，而CTLA-4Ig基因轉染可使受者體內的CTLA-4Ig在一次轉染后持續表達。目前基因治療主要有兩種方式，即間接體內法(ex vivo)和體外法(in vivo)[7]。前者需要先將目的基因轉染到體外培養的細胞后再進行移植，它的優點是選擇細胞簡單，轉導的細胞可嚴格控制，沒有病毒顆粒或其他物質直接進入體內。后者是將目的基因裝配于特定的真核細胞表達載體，然后利用表達載體系統直接導入體內。腺病毒(Ad)具有較高的轉染效率，是目前研究應用最多的基因載體，一次轉染后受體血清目的蛋白可于第3天開始表達，第7天到達峰值，其后微量表達較長一段時間[8]。

心、肝、腎等實體器官移植的有關研究結果表明，移植器官體外灌注腺病毒載體可以在不影響其他器官及組織的情況下，獲得高濃度的區域性免疫抑制效果，延長移植物存活時間，但實體臟器對熱缺血耐受時間較短，其體外灌注多在4℃的冷保存下進行，且時間多在1h左右[9-10]。 有研究表明，移植物局部灌注病毒載體，在37℃下的轉染效率明顯高于4℃下的轉染效率，如果提高體外孵育溫度、延長灌注時間，則能提高局部轉染效率[8]。但時間越長，移植物活力下降越多，吻合血管后缺血再灌注損傷必然也越大。與實體器官不同，包含皮膚的復合組織在生理溫度(37℃)下的耐缺血能力明顯優于心、肝、腎等實體器官。因此可考慮在體外37℃下進行較長時間的藥物灌注孵育，轉染效果可以明顯增強，從而獲得更好的移植物局部免疫抑制效果，延長移植物存活。

本實驗利用復合組織皮瓣移植物的這一特點，采用近交系大鼠下腹部游離皮瓣移植模型，將CTLA-4Ig基因重組腺病毒經皮瓣供養動脈灌注，并夾閉皮瓣靜脈、動脈，在37℃下進行較長時間孵育，從而提高轉染效率，并能減輕腺病毒全身轉染可能帶來的風險[11]。實驗組(C組)術后第5天皮瓣血管壁與管周組織內能定性檢測到CTLA-4Ig陽性表達，而對照組(A組、B組)未見CTLA-4Ig陽性表達，說明皮瓣局部灌注AdCTLA-4Ig后，腺病毒可穿過血管壁進到周圍組織并表達目的蛋白，復合組織皮瓣移植物局部進行CTLA-4Ig基因體外轉染是可行的。

IL-2水平是評價機體免疫狀態的重要指標之一。本實驗中各組移植術后早期發生急性排斥反應時，IL-2均有明顯升高，但實驗組血清IL-2水平在第3天、第7天時均明顯低于兩對照組(P<0.01)。移植后第7天的病理學檢查，各對照組皮瓣淋巴細胞浸潤明顯，組織結構模糊，出現典型的急性排斥反應表現，而實驗組移植皮瓣組織結構基本正常，未出現典型急性排斥反應表現。但實驗組在術后第11天也出現典型的急性排斥反應表現。以上結果表明復合組織皮瓣局部灌注AdCTLA-4Ig進行基因轉染，可以通過CTLA-4Ig的外分泌性表達，一定程度上阻止術后早期T細胞的激活，減少IL-2的產生，從而達到抑制急性排斥反應、延長移植物存活時間的目的。

總之，本實驗結果表明通過供養動脈進行復合組織移植物灌注的模型，優化體外轉染條件，將特定的免疫調節分子導入移植物局部，可以減輕急性排斥反應，延長移植物存活，為異體復合組織移植免疫耐受的研究提供了新的思路。但這種局部基因治療的抑制作用是有限的，不能完全控制全身免疫系統對復合組織移植物的反應，隨著時間的延長，最終導致移植物發生排異反應。進一步的研究應明確最佳轉染條件，如尋找更高效率的轉移載體、提高轉染病毒滴度、延長復合組織移植物灌注后離體孵育時間，及聯合應用小劑量免疫抑制藥物等，從而達到移植物長期存活的目的。

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[收稿日期]2009-05-05 [修回日期]2009-12-03

編輯/張惠娟