豬場排污溝中大腸桿菌的分離鑒定和藥敏試驗

摘要：從荊州市8家豬場的排污溝采樣100份，通過分離培養(yǎng)、染色鏡檢及生化鑒定，得到90株大腸桿菌菌株。對其進行藥敏試驗，試驗結(jié)果表明大腸桿菌已經(jīng)廣泛存在耐藥性，其中卡那霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、青霉素、氯霉素、四環(huán)素、麥迪霉素和強力霉素的耐藥率分別為54.44％、57.78％、66.67％、100.00％、53.33％、55.56％、41.11％和45.56％，其余的均在16％以上。試驗表明所采樣的豬場排污溝中的大腸桿菌耐藥性廣泛并具有多重耐藥性，為今后生產(chǎn)上合理使用藥物提供了理論依據(jù)。

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的豬的一種急性傳染病。主要表現(xiàn)為腸炎、腸毒血癥等多種臨床癥狀。該病在世界各地均有發(fā)生，在我國特別是養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的南方地區(qū)造成新生仔豬大批死亡或生長發(fā)育不良，成為發(fā)展養(yǎng)豬業(yè)的嚴重障礙之一。本研究以期掌握荊州市周邊豬場的大腸桿菌耐藥菌株的產(chǎn)生情況及擴散程度，為該地區(qū)的大腸桿菌病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器與設(shè)備手提式高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、天平等。

1.1.2培養(yǎng)基麥康凱瓊脂、M-H、普通瓊脂培養(yǎng)基等均按照參考文獻的方法在實驗室制備。

1.1.3藥敏紙片 購自杭州微生物試劑有限公司。紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑判斷標準以美國實驗室標準化委員會(UCCLS)制定的NCCL5200為依據(jù)。

1.1.4采樣來源于荊州周邊的8家豬場的排污溝。

1.2方法

1.2.1 細菌的分離純化將樣品無菌接種于麥康凱瓊脂平板上，37％培養(yǎng)18-24 h后觀察菌落的生長情況。挑取中等大小的紅色菌落，接種于伊紅美藍瓊脂平板，置37％培養(yǎng)，同時用該菌落涂片。革蘭氏染色、鏡檢，然后挑取典型菌落再接種于營養(yǎng)瓊脂和營養(yǎng)肉湯中進行純菌增殖。

1.2.2生化鑒定 將純化菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯中，37％培養(yǎng)16-18 h，按參考文獻[5]腸桿菌科細菌生化鑒定要求進行生化試驗，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 菌種保存 將純化的細菌用配制好的已滅菌的20％濃度的脫脂乳3 mL洗下混勻。用移液管分裝到3個已滅菌的青霉素瓶中。用封口膠封口，置-20℃保存。

1.2.4藥敏試驗

1)細菌培養(yǎng)。挑取普通瓊脂平板上生長的純培養(yǎng)菌落接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)16-18 h，觀察細菌生長情況。

2)菌液的制備。用接種環(huán)挑取細菌接種于普通瓊脂平板。37％培養(yǎng)18-24h，選擇形態(tài)相同的菌落1-2個，用接種環(huán)挑起細菌接種到12 cm的培養(yǎng)皿中，用移液管吸取0.1 mL的無菌生理鹽水滴入培養(yǎng)皿中。

3)貼藥敏紙片。用滅菌過的平推將細菌均勻地向一個方向涂布接種于M-H瓊脂平板表面，然后將平板每轉(zhuǎn)動60度涂布一次。共涂3次，最后沿平板邊緣涂布一圈。蓋上平皿蓋，置室溫下干燥3-5min，待平皿表面稍干后用無菌鑷子將12種藥敏紙片平放于瓊脂平板表面，并輕壓使其緊貼在上面。紙片應(yīng)貼得均勻，各紙片中心距離不小于24 mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)不少于15 mm.37％培養(yǎng)18～24h。觀察菌株的抑菌圈大小，并用最小刻度為毫米的直尺或游標卡尺，測量各抗生素對每株細菌抑菌圈的大小來判定其對藥物的耐受性，并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

從荊州周邊8個不同豬場不同車間的排污溝采樣的100份材料中共分離鑒定出大腸桿菌90株。其培養(yǎng)特性、染色反應(yīng)、生化反應(yīng)為：麥康凱瓊脂上形成紅色菌落：伊紅美藍瓊脂上為紫黑色帶(或不帶)金屬光澤；均為革蘭氏陰性兩端鈍圓小桿菌，單在或成對；均可水解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇并產(chǎn)酸；僅有少量產(chǎn)酸產(chǎn)氣。M.R試驗陽性，V-P試驗陰性，均不產(chǎn)生硫化氫，硝酸鹽還原試驗陽性，尿素酶陰性，吲哚試驗陽性，三鐵酸斜面培養(yǎng)基產(chǎn)酸變黃，有氣體無變黑現(xiàn)象。

2.2 藥物敏感性試驗結(jié)果

試驗結(jié)果見表1，90株大腸桿菌的耐藥水平較高，如氨芐青霉素、鏈霉素、四環(huán)素等，在12種抗生素中菌株普遍耐藥5-6種，有的多達11種，說明菌株耐藥譜也較廣。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)來自同一豬場的菌株耐藥譜較一致，而來自不同豬場的菌株其耐藥譜不盡相同。筆者認為這與不同豬場使用抗生素種類各異有關(guān)，也說明長時間使用單一抗生素是細菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因。因此獸醫(yī)臨床工作者應(yīng)重視用藥前的藥物敏感性監(jiān)測，選出幾種有針對性的藥物交替使用。以免延誤治療及造成藥物浪費。