熱證大鼠模型肝臟組織中腺苷酸含量的測定

摘要：通過灌胃正常大鼠甲狀腺素片(含T3，T4)制造熱證大鼠模型，正常大鼠給藥7 d，采用RP—HPLC法檢測大鼠肝臟組織中的ATP、ADP，AMP含量。結果表明。熱證大鼠模型肝臟組織中腺苷酸含量與正常大鼠比較有顯著差異。本方法簡單，結果準確，驗證了熱證大鼠模型能量代謝加快。

關鍵詞：反相高效液相色譜法；大鼠；肝臟；腺苷酸

中圖分類號：0657.7⁺；R36 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2010)04-0954-02

甲狀腺激素在體內具有廣泛的生理作用，其中最主要的是促進組織氧化及產熱。以往的研究表明。熱證機體代謝旺盛。為探討熱證與機體能量的關系，我們采取灌胃正常大鼠甲狀腺素片的方法制造熱證大鼠模型，測定大鼠肝臟中腺苷酸含量，并與對照組比較。探討熱證機體與能量代謝的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器LC—10ATVP高效液相色譜儀：SPD-10AVP紫外可見分光檢測器：Chromato—solutionlight色譜工作站；AUerge 64R型高速冷凍離心機；手動玻璃勻漿器：C0250型超聲波清洗器。

1.1.2 試劑 ATPNa₂、ADPNa₂、AMPNa₂對照品由Sigma公司提供，進口分裝，純度≥98％，批號為070601：磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、高氯酸均為分析純(廣東汕頭市西隴化工廠)；甲醇為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司)：試驗用水為娃哈哈純凈水；液氮由南昌生化試劑廠提供。

1.1.3動物與藥品 成年健康SD大鼠32只，雌雄各半，體重(200±20)g。由江西中醫(yī)學院實驗動物中心提供。甲狀腺素片，含藥量(T3，T4)為40 mg，批號為070302(浙江尖峰藥業(yè)有限公司)。

1.2方法

1.2.1 熱證大鼠模型制造方法健康SD大鼠32只，隨機分成兩組，第一組為正常對照組(雌雄各半)，灌胃給藥0.5％CMC-Na；第二組為熱證大鼠模型給藥組(雌雄各半)，灌胃給予甲狀腺素片50mg／(kg·d)，甲狀腺素片以0.5％CMC—Na配制成所需濃度的混懸液。兩組連續(xù)給藥7 d，每天一次。光照：黑夜=12h：12 h，溫度：(25+1)℃，濕度：(55+5)％。

1.2.2大鼠肝臟組織樣品處理大鼠斷頭處死，迅速取肝臟組織于液氮中保存，測定時稱取0-3 g肝臟組織于玻璃勻漿器中，加入3 mL預冷的0.6 mol，L高氯酸，在冰水浴中迅速制成勻漿液。勻漿液4℃、8 000 r／min離心10 min。精密取上清液1 mL，用1 mol／L的磷酸氫二鉀0.7 mL中和至pH值6.5左右。再4℃、8 000 r／min離心10min。取上清液經(jīng)0.45 tJ，m濾膜過濾。即得肝臟組織樣品溶液。1.2.3 RP-HPLC分析條件Hvpersil C18色譜柱(4.6mmx250mm，5μm)；C18預柱；流動相為pH值6.0的75 mmol／L KH2P04-K2HP04緩沖溶液；流速為0.7 mL／mln；柱溫為25℃：檢測波長為254nm；靈敏度為0.01AUFS；進樣量為10μL。

2 結果與分析

2.1定性試驗

精密稱定對照品ATP 5.0 mg、ADP 6.0 mg、AMP 4.0mg，置于同一50mL容量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻，配制成腺苷酸混合對照品溶液。精密稱取對照品ATP 12.4 mg、ADP 9.8 mg、AMP 6.2mg，分別置于50 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻，ATP、ADP、AMP濃度依次為248μg／mL、196μg／mL、124μg／mL，作為儲備液，置4~C冰箱保存。測定時取經(jīng)處理后的肝臟組織樣品在上述色譜條件下進樣10μL作色譜分析，ATP、ADP、AMP保留時間分別為7.3、8.5、14.3 min，峰形良好，無雜質峰干擾測定。定性結果如圖1。

2.2線性關系

回歸分析結果表明ATP在1.575～252 txg／mL范圍內.ADP在1.275-204 μg／mL范圍內，AMP在1.325-212μg／mL范圍內，線性關系良好。相關系數(shù)分別為0.999 8、0.999 3、0.999 4。ATP、ADP、AMP的回歸方程分別為：A=8.176xl(PC-4.928x103；A=1.033x104C-2.815xl(P；A=1.631x104C-5.259x104。

2.3精密度試驗

在上述色譜條件下.精密吸取腺苷酸混合對照品溶液，在同一天連續(xù)進樣6次，測定ATP、ADP、AMP的峰面積，其RSD分別為2.0％、2.6％、2.0％。

2.4加標回收率試驗

稱取大鼠肝臟組織1.2 g，平均分成4份。一份作本底值，另外3份加入標準品，計算加標回收率。肝臟組織平均加標回收率如下：ATP為95.2％.ADP為94.5％，AMP為93.6％。

2.5肝臟組織中ATP、ADP、AMP含量變化

根據(jù)上述方法測定大鼠肝臟組織中ATP、ADP、AMP的含量。結果表明與對照組比較，熱證大鼠模型給藥組ATP、ADP、AMP含量均有提高，且有顯著性差異(P<0.05)，結果如表1。

3 小結

試驗數(shù)據(jù)表明熱證大鼠模型給藥組的ATP、ADP、AMP含量均高于正常對照組且具有顯著性差異(P<0.05)。

據(jù)文獻報道，在甲狀腺激素作用下，機體物質代謝增加，相應的能量代謝也會增加，一般直接反應就是體溫升高，體重下降，飲水增多，生理狀態(tài)下，機體的寒熱可反映能量生成及利用的平衡關系，其中主要是ATP的生成、利用及產熱作用，故對熱體中ATP活性高低的研究及其他指標含量的比較研究可從一方面反映熱證與能量代謝的關系。

本試驗采用RP-HPLC法測定大鼠肝臟組織中腺苷酸含量，操作簡單，快速，重現(xiàn)性好，定性可靠。定量準確。本試驗研究表明甲狀腺激素可以提高機體的能量代謝，制造的熱證大鼠模型能量代謝水平有加快的趨勢，有關熱證大鼠模型與能量代謝的作用機理及其能量代謝指標的選擇有待進一步研究。