一種木本植物RNA和DNA的簡捷提取方法

摘要：將尾葉按(Eucalyptus urophylla)葉片在液氮中研磨成粉，先用含山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛血清白蛋白、聚乙二醇和亞精胺的提取緩沖液使總核酸沉淀，同時去除了大部分次生代謝物質。然后用山梨醇、月桂酰肌氨酸鈉進一步裂解細胞，釋放核酸。再用CTAB與核酸結合成復合物溶于高鹽溶液。用氯仿／異戊醇除蛋白質后，離心得含總核酸的上清液。運用鈣鹽分步沉淀法，先在上清液中加入1／10體積的10％氯化鈣溶液，使DNA與Ca2+結合成DNA鈣鹽。向溶液中加入1／5體積的乙醇，使DNA鈣鹽形成沉淀析出，離心得DNA后，再增大乙醇濃度使RNA鈣鹽沉淀。得到的DNA和RNA用非變性瓊脂糖凝膠進行質量檢測，可得完整的RNA和DNA條帶。此法經濟、快捷，可同時得到DNA和RNA。

關鍵詞：木本植物；RNA；DNA；非變性瓊脂糖電泳

中圖分類號：075 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2010)04-0773-03

木本植物的組織中含有較多的多糖及單寧、酚、醌、原花色素類物質等次生代謝物質。這些物質嚴重影響木本植物RNA和DNA提取效率，甚至造成提取失敗而成功提取高質量的RNA和DNA是進行分子生物學研究的必要前提，如Nofthera雜交分析、cDNA文庫構建、RT—PCR、Southern雜交分析等實驗都需要高質量的RNA或DNA。常用于植物RNA或DNA提取的方法有異硫氰酸胍法、熱硼酸法、CTAB法、SDS法等。這些方法對于某些植物的核酸提取是有效的，但對另外一些植物來說，卻并不一定是好的方法。對于木本植物而言。由于其次生代謝物質含量豐富，這些物質的化學性質又與核酸相似，所以提取過程中，次生代謝物質會嚴重干擾核酸的提取，影響核酸的得率及質量，甚至導致提取失敗。

目前，常規的核酸提取方法或使用的試劑盒大多是針對單獨的RNA或DNA的提取。用常規方法常易失敗，而試劑盒不僅價格昂貴，而且適用于木本植物的試劑盒更是很少。

目前，文獻中還沒有報道用同一材料同時得到分離的RNA和DNA用于不同方面研究的報道。本研究以此為出發點，嘗試從木本植物中同時得到分離的RNA和DNA，并通過瓊脂糖電泳檢測所提核酸的完整性。

1 材料與方法

1.1 植物材料

尾葉桉新鮮葉片。

1.2實驗試劑

提取緩沖液：50 mmol／L Tris(pH值8.0)、35mmol／L山梨醇、5 mmol／L EDTA、10％(W／V)聚乙二醇4000、5％(W／V)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.2％(W／V)亞精胺和0.1％(W／V)牛血清白蛋白。洗滌緩沖液：50mmol／L riffs(pH值8.0)、35mmol／L山梨醇、25 mlil01／L EDTA。氯仿／異戊醇(24：1，V／V)、10％(W／V)月桂酰肌氨酸鈉、5m01／L NaCl、含NaCl0.7mol／L的10％(W／V)CTAB、無水乙醇、70％乙醇、IO％CaCl₂、TE或無菌水、1xTBE、Gold View核酸染料。

1.3 RNA和DNA的提取

稱取約100mg新鮮尾葉桉葉片，在液氮中研磨成細粉后轉移到2mL的離心管中：加入1.5mL提取緩沖液，顛倒混勻，3 000xg離心10 min；去上清，將沉淀懸浮于0.5 mL洗滌緩沖液中，依次加入10％月桂酰肌氨酸鈉150 o，L、5 mol／L NaCl 150 txL、8.6％(W／V)CTAB和0.7 mol／L NaCl 200 IxL，混勻后65℃水浴20-30min；取出離心管自然冷卻，加入l mL氯仿／異戊醇(24：l，V／V)混勻、靜置5 min后，14 000xg離心10min；轉移上清至新管，加入1／10體積的10％氯化鈣溶液。混勻后靜置5 min，再加入1／5體積無水乙醇靜置10min后，12 000xg離心5rain；將上清轉移至新管，DNA沉淀暫時保存。向上清中加入1.7倍體積的無水乙醇，靜置20 min，12000xg離心5min。去上清，得RNA沉淀；分別用l mL 70％的乙醇洗滌上述沉淀，12 000xg離心5min。去上清，在超凈工作臺上晾干后加20μL TE溶解。CTAB法提取核酸參照王關林等的方法。TaKaRa公司RNiso試劑提取RNA方法參照說明書進行。葉片用量都為100 mg，最后都加20μrL TE溶解。

1.4 RNA和DNA電泳檢測

配制1.0％瓊脂糖凝膠，按100mL加入5μL的比例添加Gold View核酸染料。上樣量2μL。電泳緩沖液為1xTBE，5V／cm恒壓電泳1 h。電泳結束后在紫外燈下用數碼相機照相。

2 結果與分析

非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA和DNA的質量，結果如圖1所示。泳道1中DNA條帶亮度低，RNA呈掃帚狀，無明顯條帶。說明CTAB法很難從富含多酚的木本植物中提取核酸。泳道2為本方法提取的總核酸，DNA條帶亮度高，RNA可見有明顯的28S、18S和5.8S rRNA條帶，且28S條帶的亮度約為18S條帶亮度的兩倍。說明此方法得率高，RNA完整、無明顯降解。泳道3為本方法從總核酸中沉淀的DNA。與總核酸泳道(泳道2)中的DNA相比，條帶亮度減弱，說明DNA沉淀不完全。但泳道中無RNA片段，說明DNA從總核酸中完全分離，純度高，無RNA污染。泳道4為本方法從總核酸中沉淀的RNA。與總核酸泳道(泳道2)中的RNA條帶相比，條帶亮度減弱，說明RNA沉淀不完全。同時，泳道中仍有極少的DNA，進一步證實了分步沉淀時，DNA沒有完全沉淀出來。但泳道4中28S、18S和5.8S rRNA條帶明顯可見，證明提取的RNA降解少，片段完整。泳道5為用專門的木本植物RNA提取試劑RNiso提取得到的RNA，其帶型及亮度與泳道4幾乎完全相同，也有少量殘留的DNA，說明此試劑提取RNA的得率和純度與本方法一樣。

3 討論

本方法從木本植物桉樹葉片中同時分離得到了RNA和DNA，并用非變性瓊脂糖電泳檢測了所提核酸的完整性。常規的RNA提取方法，如異硫氰酸胍法、RNiso試劑法，不僅需要苛刻的實驗條件，而且所用的試劑含有重金屬、酚、胍、強變性劑等污染環境的物質。另外，實驗花費也相當大。本方法用常規試劑可以從木本植物中同時分離到完整的RNA和DNA，總核酸降解少，提取效率較高。雖然RNA中有少量DNA污染，但這是專業試劑也難以避免的現象，可通過加入DNase除去。本方法經濟快捷，又避免了使用β-巰基乙醇、DEPC、溴化乙錠和甲醛等毒性大的試劑，減少了對實驗操作人員的毒害及對環境的污染，具有較好的經濟效益、生態效益和開發前景。