利用木糖發酵高產酒精菌株的誘變育種和馴化研究

賴　穎　郭翠等

賴穎 閔偉紅 張大力 吉林農業大學食品科學與工程學院 130118

摘要:本文以熱帶假絲酵母作為出發菌株,進行了紫外誘變和馴化,利用木糖生產燃料酒精,以獲得高產菌株。通過實驗得出:紫外誘變時最佳的菌液稀釋倍數為10-4,最佳紫外照射時間為35s,通過三輪的紫外誘變育種進行篩選,獲得酒精產量較高的菌株,其中突變株YⅢ27,酒精產率達到了6.78%,木糖利用率為71.1%。對突變株Ⅲ27進行了馴化,馴化后的菌株,酒精產率提高到9.6%,木糖利用率達到了90.3%。

關鍵詞:熱帶假絲酵母;誘變;木糖

在全球環境惡化和能源危機日益嚴峻的今天,燃料乙醇作為一種可利用的綠色能源正逐漸成為各國能源發展的戰略方向。采用傳統的以玉米、小麥等糧食為原料的發酵方法對糧食的需求量很大和成本高的缺點逐漸顯現出來,己不能滿足市場的需要。尤其我國是個人口大國,糧食安全是關系到人民生活和社會穩定的重大問題。所以我國在“十一五”計劃中大力提倡用非糧原料生產燃料乙醇[1]。

我國以農作物秸稈為代表的木質纖維素類生物質資源十分豐富,年產量高達6億多噸,大部分未能被有效利用,造成資源嚴重浪費。木質纖維素的主要成分是纖維素、半纖維素和木質素混合在一起的材料。在植物纖維素中,纖維素、半纖維素占木質纖維素質量的70%,纖維素和半纖維素必須經過水解分別形成六碳糖和五碳糖后,才能被微生物利用,發酵生產乙醇。天然半纖維素水解產物的85-90%是木糖。以植物纖維素原料中的木糖發酵生產乙醇,能使木質纖維素原料的乙醇發酵的產量在原有的基礎上增加25%。因此,實現木糖發酵生產乙醇是決定植物纖維資源生產乙醇經濟可行的關鍵因素。

木糖過去一直被認為不能被微生物發酵成乙醇,Karczewska[2]第一次提出用木糖發酵乙醇,但這個發現未引起足夠重視,直到1980年,wang等人提出木糖可被一些微生物發酵成乙醇。迄今為止已經發現有一百多種微生物能夠利用木糖,其中酵母菌的發酵能力是最強的,也利于工業生產應用。本文以中科院微生物所購買的熱帶假絲酵母為出發菌株,進行了誘變和馴化,該菌顯現出良好的改造及應用前景。

1. 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

熱帶假絲酵母(G.tropicalis)購自中國微生物菌種保藏管理中心

1.1.2培養基

木糖固體培養基:木糖20g/l,蛋白胨20g/l,酵母粉10g/l,瓊脂20g/l。

木糖液體培養基:木糖20g/l,蛋白胨20g/l,酵母粉10g/l。

酵母木糖發酵培養基:木糖50g/l,KH2PO42g/l,酵母粉1g/l,MgPO41g/l。

酵母木糖馴化培養基:木糖20 g/l-70g/l,蛋白胨20g/l,酵母粉10g/l。

1.1.3試劑和儀器

滅菌器,空氣搖床,超凈工作臺,旋轉蒸發器,2100分光光度計,試管、平皿,三角瓶,比色皿、酵母浸粉,蛋白胨,木糖,瓊脂粉,試劑a(0.32085g高碘酸鈉溶于100mL的1%稀鹽酸溶液中),試劑b(1.11g/L的鼠李糖溶液),

Nash試劑(現配現用,150g/L乙酸鈉100mL溶液中加入0.2mL乙酸和0.2mL乙酰丙酮)等。

1.2試驗方法

1.2.1乙醇含量測定的標準曲線——重鉻酸鉀比色法[3]

吸取1ml無水乙醇于100ml容量瓶中,稀釋至刻度,混勻。分別吸取此稀釋液0、1、2、3、4、5、6、7ml于50 ml容量瓶中,各加15.0 ml重鉻酸鉀溶液,加水至刻度,混勻。此標準系列相當于試樣中含有0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00(V/V)的酒精。以空白標準作參比,在波長600nm,用1cm比色皿測定其余各標準的吸光度。用吸光度對酒精濃度作圖,繪標準曲線。

1.2.2 木糖含量的測定

將1mg/ml的標準木糖母液用去離子水按不同比例稀釋成含糖量為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8mg/ml的標準木糖液。取有刻度試管,加入1ml標準糖液+1mlDNS混勻于沸水浴5min后,冷卻,用蒸餾水補充至10ml,于490nm處測吸光值。

1.2.3生長曲線的測定

(1)挑取一環4℃下保存的菌落于200mLYEPD液體培養基中,在30℃和l00r/min的條件下培養18-24h進行活化培養,即得液體種子。

(2)配制YEPD液體培養基3200mL,分裝于三角瓶中,每個三角瓶中準確加入100mL。于115℃下高壓蒸汽滅菌30min。

(3)將活化好的液體種子接種于每個三角瓶中,接種量為6%。

(4)將三角瓶在100r/min的搖床中30℃下培養。每間隔2h取一次樣,測其600nm處的吸光值。

由圖3可知,1號菌株在2h之后進入對數生長期,在48h的時候OD值達到最大,然后進入平穩期。

1.2.4紫外誘變方法[4]

挑取一環對數期的原菌于9mL的蒸餾水中,振蕩均勻后吸取1mL的菌懸液于9mL的蒸餾水中,這樣依次稀釋至10-7的濃度,依次吸取10-1～10-7菌濃度的菌懸液100μL于50個裝有完全培養基凝固平板中,每個稀釋度各10個平板,均勻涂布,取兩組10-1～10-5稀釋度平板作對照,后八組分別于紫外線下誘變20s,30s,35s,40s。將誘變后的平板和對照平板在無光條件下30℃培養2d,觀察并查菌落數。經過試驗結果得出致死率最佳稀釋度和紫外誘變時間。

1.2.5木糖發酵菌的馴化

為穩定和提高篩選酵母利用木糖發酵酒精的能力,將篩選菌株接入酵母木糖馴化培養基馴化[5]培養數代,并逐步提高發酵液中的初始木糖含量,根據秸稈水解液中木糖含量,將木糖含量的上限控制在7%,直至菌體適應木糖含量上限. 將馴化后的菌株接種發酵,測定其酒精濃度、殘糖濃度、pH等參數,研究其發酵性能。

用滅菌后的接種環挑取2環酵母菌接種至木糖濃度為20g/L的100mlYEPD液體培養基中,30℃搖床90r/min連續培養96h,其后以6%的接種量將菌液接入木糖濃度為30g/L的液體培養基中,30℃搖床90 r/min再次連續培養96h,以此類推直至在木糖濃度為70g/L 的液體培養基中培養完畢完成菌株的定向馴化。

2. 結果與分析

2.1 紫外線最佳照射劑量的選擇

紫外線照射時間對熱帶假絲酵母致死率的影響見表1。

紫外線照射對熱帶假絲酵母有明顯的致死效應,致死率隨照射劑量增大而增大。由表2可以看出,出發菌株對紫外線照射的耐受能力較強,菌濃度分別為103 ,104,105時,在35s時 的處理條件下,其致死率為80.06 %～85.91%. 為保證有較高的篩選機率,選擇35s作為紫外線照射劑量。

2.2 紫外線照射后突變株的選擇

菌種經過3 次誘變后從其中挑選菌落直徑較大者38株,接入斜面,從中選出8 株產酒精能力明顯高于其它突變株,其產酒精能力見表2。由表2可以看出,經過傳代試驗,只有YⅢ11、YⅢ27 能穩定產酶且酶活力較高,其中YⅢ27 產酒精能力最高為6.78%。

2.3馴化菌種

為穩定酵母利用木糖的能力,將菌株接入酵母木糖馴化培養基馴化培養數代,并逐步提高發酵液中的初始木糖含量,馴化后菌體逐漸適應了木糖發酵液環境,對代謝過程中的有害物質的抵抗力逐漸增強,木糖的利用率顯著提高,酒精產量提高,見表3。

3. 結論

本試驗以購買的熱帶假絲酵母菌株為誘變出發菌株,經過紫外線誘變及馴化篩選后,得到1株穩定的產酒精生產菌株。熱帶假絲酵母的誘變育種最佳條件為紫外線照射時間35s ,菌濃度104,酒精產率由出發菌3.28% 提高到6.78%,木糖利用率由45.3%提高到71.1%,馴化之后突變株YⅢ27的酒精產率提高到9.6%,木糖利用率達到了90.3%。但是該菌株酒精產率還達不到工業化生產水平,應繼續采用基因工程育種方法提高其產酒精水平,使之能應用于工業生產。

參考文獻:

[1] KerstinSkoogandBarbelHalin一Hagerdal.EnzymeMierob.Teehnol.

1988;10(2):66.

[2]PREEZ D J C. Process parameters and environmental.

facters affecting D - xylose fermentation by yeasts [ J ].

EnzymeMicrob Technol, 1994, 16 (8) : 943 - 955.

[3]沈怡方,白酒生產技術全書(第一版)[M]北京:中國輕工業出版社,1998,654-655.

[4]王莘.紫外線的誘變育種.發酵工藝原理實驗技術 2004,10.

[5]Skoog K,et al.Enzyme Microb.Technol.1988,10(2);66-88.

作者簡介: 賴穎,周口師范學院教師,助教 女 1981年8月4日 畢業院校 大連工業大學 本科,專業:生物工程,現在 吉林農業大學在讀研究生 研究方向:發酵工程。