水產(chǎn)品中己烯雌酚快速檢測方法試驗分析

柳愛春　劉　超　徐曉丹　孔世佳

摘要對一種快速檢測水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量ELISA方法進(jìn)行試驗分析,結(jié)果表明:在0.15~9.00ng/mL濃度范圍內(nèi),回歸方程y=-13.141Ln(x)+43.52,相關(guān)系數(shù)R2=0.994 8;相對平均偏差為3.0%~11.6%;回收率為73%~96%;樣品檢測下限為0.075ng/g;定量下限為0.25ng/g;操作過程簡單,檢測成本低,檢測時間短,因而該方法適用于大批量水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量快速檢測。

關(guān)鍵詞水產(chǎn)品;己烯雌酚;ELISA;快速檢測

中圖分類號 S912 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)15-0347-01

己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)是一種人工合成的雌性激素,應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)同化,提高飼料轉(zhuǎn)化率,同時促進(jìn)魚蝦類生長。但因其在水產(chǎn)動物中代謝較慢且作用頑強(qiáng),極小的殘留都會對人體生理功能產(chǎn)生影響,主要危害是擾亂人體激素平衡,并具有致癌性,現(xiàn)已被禁止應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中,規(guī)定水產(chǎn)品中不得檢出己烯雌酚[1]。為此,從2002年開始我國要求水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的檢出限為0.6 μg/kg,歐盟要求以2μg/kg為陽性下限。目前,己烯雌酚常用的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)和酶聯(lián)免疫法(ELISA),但是HPLC法[2]在檢出限上不能滿足要求;ELISA法[3]是目前水產(chǎn)品中DES殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法,但也存在樣品處理過程復(fù)雜、檢測時間長、成本高等不足。為了尋求一種經(jīng)濟(jì)、簡便、靈敏、特異性強(qiáng)的測定方法,筆者對一種快速檢測水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的ELISA方法進(jìn)行試驗分析,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Lab system MK3型酶標(biāo)儀、METTLER PB602-N電子天平、N- EVAP氮吹儀、LRH-150S恒溫培養(yǎng)箱、移液器(10μL、20μL、100μL和1mL各1支)、多道移液器(50~300μL)。

美國Bioo MaxSignalTM己烯雌酚ELISA試劑盒、乙酸乙酯、正己烷、無水CaCl2。

1.2測定方法

1.2.1預(yù)處理。蝦、蟹、甲魚和淡水魚取肌肉部分,用勻漿器對樣品進(jìn)行勻漿。

1.2.2提取。稱取3.00g勻漿樣品(每個樣品稱2份),加入9mL乙酸乙酯,0.3g無水CaCl2,最大速度振蕩3min;20℃,6 000rpm離心5min;移取6mL上清液到另一新的試管,氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.2.3凈化。加入2mL正己烷溶解樣品;加入1mL1×PBS-甲醇(3∶2,V/V),漩渦振蕩2min;20℃,6 000rpm離心10min,除去上層正己烷層,部分蟹樣再次加入正己烷重新凈化1次,取50μL下層溶液進(jìn)行檢測。

1.2.4質(zhì)控。取不同批次的南美白對蝦和中華絨螯蟹樣品,以20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加3個不同的濃度水平測試回收率,同時做空白。提取、凈化過程同1.2.2和1.2.3。

1.2.5ELISA反應(yīng)測試步驟。將Bioo試劑盒從冷藏箱取出,并回溫至室溫。按說明書稀釋抗體、洗液和PBS;根據(jù)樣品數(shù)量確定所需的微孔板數(shù),設(shè)計好標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控和樣品的排布(每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和每份處理后待測溶液均設(shè)平行雙孔);分別加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品于所設(shè)定的孔中;在每孔中加入100μL一抗,混勻1min;室溫(20~25℃)孵育30min;洗板3次,每次加入250μL1×洗液,最后一次將板盡量甩干并在吸水紙上吸干;每孔加入150μL二抗;室溫避光孵育30 min;洗板3次,每次加入250μL 1×洗液;加入100μL的TMB底物,輕敲微孔板邊緣混勻1min;在室溫下培養(yǎng)15min,加入100μL的終止液終止反應(yīng),在450nm下讀OD值。

2結(jié)果與分析

2.1線性范圍

分別計算標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控和樣品的平均吸光度值和相對吸光度值:相對吸光度值(%)=(標(biāo)準(zhǔn)或樣品吸光度值/零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值)×100;以相對吸光度值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。

2.2精密度和回收率

從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取質(zhì)控和樣品的濃度值,計算南美白對蝦和湖蟹樣品的精密度和回收率(見表1、表2)。

2.3檢測限

從圖1可知,0.15~9.00ng/mL濃度范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)最低濃度0.15ng/mL,計算樣品檢測下限=0.15ng/mL×1mL×6mL/(4mL×3g)=0.075 ng/g;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)次低濃度為0.5ng/mL,計算樣品定量下限=0.5ng/mL×1mL×6mL/(4mL×3g)=0.25ng/g。

2.42種方法檢測DES比較

2種方法檢測DES的成本、時間比較見表3。

3結(jié)論與討論

通過以上試驗可知,快速檢測水產(chǎn)品中己烯雌酚的方法在檢測限、定量范圍、精密度、回收率(73%~96%>70%)等技術(shù)指標(biāo)上都滿足標(biāo)準(zhǔn)[3]規(guī)定的要求;將其與德國r-biopharm己烯雌酚ELISA試劑盒相比,操作過程簡單,檢測成本低,檢測時間短,因而該方法非常適于大批量檢測水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留含量。同時,在試驗中發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹樣品的回收率比南美白對蝦低,而在相同濃度下的相對平均偏差卻較高。這可能與中華絨螯蟹樣品脂肪含量相對較高,提取物經(jīng)過2次凈化有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

[1] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.NY5070-2002 無公害食品、水產(chǎn)品中魚藥殘留限量[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2002.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.108-2003 畜禽肉中己烯雌酚的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2002.

[3] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.SC/T 3020-2004 水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的測定 酶聯(lián)免疫法[S].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2004.