阿維菌素類藥物殘留檢測方法的研究進展

羅曉琴　張春葉

摘要阿維菌素類藥物作為一種抗寄生蟲藥物,近年來在農業和畜牧業生產中得到廣泛應用。就國內外有關AVMs殘留檢測方法作一綜述,為更加深入、全面地了解動物性食品中AVMs殘留研究奠定基礎,同時為開展AVMs殘留檢測提供參考。

關鍵詞阿維菌素;藥物殘留;檢測方法

中圖分類號S851.34+7.109文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)15-0334-02

寄生蟲病是家畜常見的、危害嚴重的疾病之一,阿維菌素類藥物(Avermectins,AVMs)的開發,開辟了寄生蟲藥物的新里程碑,使抗蠕蟲藥物作用劑量由mg/kg級下降到μg/kg級。AVMs對線蟲和體外節肢動物有較強的驅殺作用,為農作物保護、動物和人類健康做出了重大貢獻 [1-3]。但是,AVMs作為脂溶性藥物,在動物體內的殘效時間較長[4],因此按世界衛生組織(WHO)5級分類標準,仍將其列為高毒化合物。阿維菌素類藥物有阿維菌素、伊維菌素、埃普利諾菌素、多拉菌素(DOR)、莫西菌素、塞拉菌素和甲胺基阿維菌素等藥物[5,6]。

目前隨著人們對畜禽產品質量要求越來越嚴格,幾乎每個國家對食品中獸藥殘留都有相關的限量規定。因此,動物組織中AVMs殘留成為獸藥殘留研究領域重點監控對象之一,殘留檢測方法顯得極其重要。目前,關于AVMs在動物性食品中的單殘留和多殘留檢測方法,國外報道相對較多一些,國內報道很少。

1國內外檢測方法研究進展

1.1薄層色譜法(TLC)

Malanikova等曾使用TLC法檢測阿維菌素,在硅膠薄層板上涂上熒光指示劑,用于樣品檢測。但TLC與高效液相色譜法相比較,靈敏度較低(1 000×10-9),一般只作定性分析,很少用于殘留檢測[7]。

1.2液相色譜-紫外檢測方法(HPLC-UV)

根據阿維菌素類藥物的共軛二烯結構在λ=240~250nm處有強烈的紫外吸收,建立起液相色譜-紫外檢測方法,一般采用反相液相色譜法[8,9]。由于阿維菌素類藥物在體內的最小有效濃度很低,而紫外檢測器對阿維菌素類藥物的最低檢測限為1~2ng/mL[10],很難檢出。而且,紫外檢測器檢測選擇性不高,關于AVMs的UV測定法并不適合AVMs的殘留分析[11],HPLC-UV法多用于制劑中阿維菌素類藥物的檢測,而很少用于實際樣品集體殘留檢測。

1.3液相色譜-熒光檢測方法(HPLC-FLD)

與紫外檢測器相比,熒光檢測器更靈敏,高約100倍,對樣品量很少或濃度非常低的痕量分析特別適用。由于許多物質不發射熒光,只有那些具有對稱共軛和非強離子化的化合物才能發射熒光,因此HPLC-FLD檢測法受基體干擾少。與HPLC-UV比較,此方法大大提高了檢測限,如在血漿中的AVMs檢測限已達到0.02ng/mL[12]。然而由于AVMs本身沒有對稱共軛結構,不能直接用熒光檢測器檢測,而只有經熒光衍生化后,生成具有對稱共軛的苯環結構才能發射熒光。

1.4液相色譜-質譜檢測方法(HPLC-MS)

阿維菌素類藥物殘留檢測的確證方法也得到了發展:HPLC-MS法檢測靈敏度高,能方便地對痕量獸藥多殘留組分進行檢測,同時能對獸藥殘留組分進行結構確證,因而極可能成為AVMs多組分殘留確證檢測的最佳方法之一。Howells和Saner以大氣壓化學電離-質譜(APCI/MS)方法測定了AVMs、IVM、EP、DOR 和MOX殘留,定量限分別為3.1ng/g、3.2ng/g、2.2ng/g、4.0ng/g和3.2ng/g[13]。Gia-nell等以電子轟擊離子化-質譜(EI/MS)方法檢測了IVM殘留[14]。

1.5液相色譜-質譜-質譜聯用技術(LC3/MS3/MS)

LC3/MS3/MS法在液質聯用法的基礎上再進行質譜串聯,能同時檢測更多種藥物,減少了工作量。Sheridan1R等[15]研究報道了牛奶中5種AVMs驅蟲劑,即伊維菌素、阿維菌素、依立菌素、莫西菌素和米爾倍霉素的多殘留檢測方法,此方法使用簡單的液液萃取,后用液相色譜-質譜-質譜聯用技術(LC-MS-MS)進行定性、定量分離檢測。

1.6在線超臨界流體凈化技術(SF3/HPLC3/FLD)

用于AVMs的多殘留檢測方法,在線SF3/HPLC3/FLD主要優點在于實現分離分析自動化,能定量地將萃取物轉入分析系統,靈敏度高,適于痕量組分的分析。Danaher等建立了動物肝臟中阿維菌素、伊維菌素、依立菌素和多拉菌素多殘留的超臨界流體凈化方法。

1.7免疫親和色譜技術(immunoaffinity chromatography,IAC)

以免疫結合反應為基礎的柱色譜技術,其原理是將抗體與惰性基質偶聯制成免疫吸附劑,裝柱。當待測組分流經IAC 柱時,抗原與相應抗體選擇性結合,其余雜質則流出IAC 柱。再用適宜的洗脫溶劑將抗原洗脫,使樣品得到有效分離、凈化和濃縮。其操作方式有分批法和柱色譜法2種,并且IAC柱再生處理后可重復使用。MIAC(multi-immunoaffinity)和高效親和色譜(HPIAC)是其發展方向。

1.8酶聯免疫法(ELISA)

酶聯免疫法(ELISA)是以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎的分析技術。由于阿維菌素類藥物是半抗原,不能刺激機體產生抗體,需與大分子載體物質(如蛋白質)相結合制備人工抗原,使其具有免疫源性,免疫動物產生特異性的抗體,然后建立免疫競爭法。此方法簡單、快速,且不需要昂貴的儀器設備,適合于大批量樣品篩選,便于推廣。ShiW等[16]研究報道了牛肝組織中阿維菌素、伊維菌素、依立菌素的多殘留檢測間接競爭ELISA。篩選具有對AVMs最高抗體滴度的血清作為間接競爭ELISA反應,此血清與阿維菌素的交叉反應率為100%,與依立菌素的交叉反應率為145.4%,與伊維菌素的交叉反應率為25%。此方法的定量檢測限為1.06ng/mL。

2前景展望

綜上所述,各種檢測方法均有其優勢和相對的不足之處。由于阿維菌素類藥物臨床使用劑量小,分子量大,極難氣化,無法使用氣相色譜(gas chromatography,GC)檢測,而薄層色譜法檢測限高,不夠靈敏,達不到殘留分析的要求。高效液相色譜法(HPLC)靈敏度高,檢測限能夠低于最高殘留限量(MRL),方法穩定、精確度高、特異性強,但是存在樣品前處理復雜、需要專業的操作人員、花費較高等不足之處。液質聯用法(LC-MS-MS)由于結合了質譜技術,檢測靈敏度可以達到納克、皮克水平,因此常用于確證分析,尤其是在國外應用較多,但由于其檢測成本較高,在國內推廣應用受到限制。

相比之下,酶聯免疫分析(ELISA)法不僅避免了HPLC法樣品前處理復雜和耗時、單個樣本檢測成本高等缺點,還具有靈敏度較高、特異性強、適用于大量樣品的快速篩選等優點。因此,免疫學檢測方法在基層大規模篩選檢測中有廣泛的應用前景。

3參考文獻

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