偽狂犬病毒ＴＫ基因缺失通用轉移載體的構建及初步應用

韓靜芳　陳瑞愛　邵定勇　唐滿華　梁桂益

摘要以偽狂犬病毒為載體表達其他病原體抗原蛋白是偽狂犬病疫苗研究的一個重要方向。根據已發表的偽狂犬病毒(PRV)Ra株TK基因序列設計2對引物,用PCR方法得到同源左右臂,克隆入PUC19載體中。利用平末端連接的方法將綠色熒光蛋白(EGFP)的基因表達盒插入到缺失位點,并在下游引入1個多克隆位點,構建缺失通用轉移載體PUC19TK-EGFP。用脂質體轉染試劑盒將PUC19TK-EGFP和PRV-Ra株的基因組共轉染BHK細胞,以EGFP為標記基因,用噬斑法得到純化的重組病毒,命名為TK/EGFP,為研制以偽狂犬病毒為載體的二價或多價基因工程疫苗奠定了物質基礎。

關鍵詞偽狂犬病毒; TK基因;通用轉移載體

中圖分類號 S858.292 文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)15-0308-03

ConstructionandPrimaryApplicationofUniversalTransferVectorDeletingTK ofPseudorabiesVirus

HAN Jing-fangCHEN Rui-ai*SHAO Ding-yongTANG Man-huaLIANG Gui-yi

(Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co., Ltd., XinxingGuangdong 527400)

AbstractUse of PRV as a system for expression of foreign antigens has been increasingly evaluated as an alternative to conventional vaccine production system. In this study,according to the Genbank open sequence,two pairs of primer were designed in order to obtain homology recombination arms of TK gene of PRV-Ra strain. Then both of them were inserted into PUC19 vector. A report gene expression cassette,EGFP containing a multicloning sites,was inserted into PUC19HEK/TK to construct a universal transfer vector PUC19TK-EGFP. It was used to co-transfect BHK cell together with the genome of PRV Ra strain,a recombinat virus was selected and purified 3 times in BHK cell through EGFP gene and named TK/EGFP. The above results demonstrated that the universal transfer vector might be contributive to developed bivalence or multivalence genetically engineering vaccine in the future.

Key wordsPseudorabies virus ;TK gene;universal transfer vector

偽狂犬病(Pesudorabies, PR)是由偽狂犬病病毒(Pesudo-rabies virus,PRV)引起的多種家畜和野生動物的一種急性傳染病,是嚴重危害全球養豬業的傳染病之一[1]。 PRV屬于皰疹病毒科(Herpesviridac)、α-皰疹病毒亞科(Alphaher-pesririnae)水痘病毒屬(Varicello virus)的皰疹病毒Ⅰ型(Porcine herpesvirus TypeⅠ),其基因組為雙鏈DNA,全長約150kb,編碼72～100種蛋白質,存在許多與病毒復制無關的非必需基因,在這些非必需基因中能夠插入其他病原的免疫原性基因或報告基因而不影響病毒的增殖。PRV的這種特性為其作為病毒活載體用于構建二價或多價基因工程疫苗提供了分子操作基礎[2]。病毒的胸苷激酶基因是PRV的主要毒力基因,也是病毒的非必需基因,將該基因缺失不影響病毒在細胞中的增殖,但其毒力大大降低[3]。本研究用PCR方法擴增了TK基因的左右臂TKL和TKR,并克隆到PCU19載體中,這樣在TKL和TKR基因之間缺失了203bp,用平末端連接法在此位點插入帶CMV啟動子和多克隆位點的EGFP報告基因,構建通用轉移載體,并用蝕斑法得到純化的缺失重組病毒TK-/EGFP。由于在EGFP的下游引入1個多克隆位點,這為將來構建以偽狂犬病毒為載體基因工程苗奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒與細胞系。偽狂犬病毒(PRV)Ra株購自中國獸藥監察所,BHK-15細胞由廣東大華農生藥研發中心保存。

1.1.2質粒與菌株。載體pcDNA 3.0(含EGFP基因)、載體PUC19以及大腸桿菌DH5α均由廣東大華農生藥研發中心保存。

1.1.3工具酶與試劑。LA Taq DNA聚合酶、XbaⅠ、KpnⅠ等多種限制性內切酶、T4連接酶、Klenow末端補平酶以及DNA Marker DL 2000等均購自大連寶生物工程有限公司;質粒回收試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自上海生物工程公司;脂質體Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產品。

1.1.4培養基與血清。細胞基礎培養基DMEM和小牛血清為GIBCO公司產品;細菌培養用LB培養基和瓊脂粉均購自廣州美津生物技術有限公司。

1.1.5PCR引物設計。參照Genbank上發表的PRV-Ra株的TK基因序列合成2對引物用以擴增左右重組臂(TKL 、TKR分別為959bp和977bp),由上海生物工程公司合成。

P-TKLs:5′-ATTGGTACCGCTGCTCGTCCACCTC GG-3′(KpnⅠ)

P-TKLa:5′-GTCTCTAGAAGTACGCCATCGGCTC GG-3′(XbaⅠ)

P-TKRs:5′-GTCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACC CG-3′(XbaⅠ)

P-TKRa:5′-ATTGCATGCCCGACCAGGACGAACA GG-3′(SphⅠ)

合成引物Ps、Pa,用以檢測重組病毒中TK缺失基因,大小約為600bp,由上海生物工程公司合成。

Ps:5′-GCGTTCGTAGAAGCGGTTGTG-3′

Pa:5′-GTGTTGACCAGCATGGCGTAGA-3′

合成引物Ps-EGFP、Pa-EGFP,用以檢測重組病毒中EGFP基因,大小為206bp,由上海生物工程公司合成。

Ps-EGFP:5′-GGGAGGATTGGGAAGACA-3′

Pa-EGFP:5′-AAGGGAAGAAAGCGAAAG-3′

1.2方法

1.2.1病毒的增殖與基因組的提取。病毒的增殖和基因組的提取,按參考文獻[4]略作修改進行。

1.2.2TKL、TKR臂的PCR擴增。在50μL的PCR體系中含有如下成分:2×GC BufferⅡ(5mM Mg2+Puls)25μL、dNTP Mixture(2.5mM)2μL、Ps(5μM/L)3μL、Pa(5μM/L)3μL、模板2μL、LA Taq(5U/μL)1μL、ddH2O 13μL。均勻混合后迅速放入PCR儀進行以下程序:先94℃預變性3min,再94℃變性30s,55℃復性30s,72℃延伸1min進行30個循環,然后72℃延伸10min,PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3含EGFP基因表達盒的重組轉移載體的構建。用KpnⅠ/XbaⅠ同時酶切TKL和PUC19,回收相應片段,連接、轉化、克隆、鑒定,得到PUC19-TKL;再用SphⅠ/XbaⅠ雙酶切TKR和PUC19-TKL,回收相應片段,連接、轉化、克隆、鑒定,得到PUC19-TK。依次消除PUC19-TK中的HindⅢ、EcoRⅠ和KpnⅠ等3個酶切位點,得到的質粒稱為PUC19/HEK-TK。

用XbaⅠ酶切質粒PUC19/HEK-TK,回收片段用Klenow補平并去磷酸化;同時用SspⅠ/StuⅠ酶切質粒pcDNA3.0-EGFP,回收大小為2.9kb含CMV啟動子的EGFP片段,用Klenow補平,將兩片段連接、轉化、克隆、鑒定,得到重組轉移載體PUC19TK-EGFP。

1.2.4重組病毒的構建、篩選、純化及鑒定。

(1)共轉染。將重組轉移載體PUC19TK-EGFP和PRV Ra的基因組用脂質體共轉染法按Lipofectamine 2000 說明書方法轉染BHK細胞,待細胞出現80%病變時收獲病毒。

(2)重組病毒的篩選及純化。將收獲的病毒反復凍融3次后10倍系列稀釋,接種于BHK細胞已長成單層的6孔細胞培養板,37℃吸附1h,用PBS洗滌3次,每孔加入2mL含2%瓊脂糖、3%小牛血清的無酚紅DMEM覆蓋,置于37℃ 5% CO2培養箱中,24h后,再覆蓋1.5mL含1/15 000中性紅和2%瓊脂糖的無酚紅DMEM,于37℃ 5%CO2培養至噬斑出現,刮下發熒光的單個分散的噬斑,與BHK細胞同步接種于24孔板中進行增殖,待細胞出現80%以上病變時收獲病毒。如此反復純化3次。

(3)重組病毒的PCR鑒定。①重組病毒TK缺失基因的鑒定。將篩選到的病毒擴大培養后提取基因組,用Ps、Pa引物擴增TK缺失基因,同時用原始毒株基因組作對照。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。②重組病毒EGFP基因的鑒定。將篩選到的病毒擴大培養后提取基因組,用Ps-EGFP、Pa-EGFP引物擴增EGFP缺失基因片段。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2結果與分析

2.1TK基因重組左右臂的PCR擴增

以PRV Ra株基因組為模板,用設計的引物進行PCR擴增,在1%的瓊脂糖凝膠中電泳,左臂可見擴增出大小約1 000bp的片段,與預期結果相符(見圖1),測序結果略。

2.2重組轉移載體的鑒定

利用設計在TKL和TKR基因片段上的酶切位點對載體PUC19-TK分別進行雙酶切,均得到約1 000bp的片段,與預期相符(見圖2)。位于通用轉移載體PUC19-EGFP多克隆位點中的EcoRⅠ為單一酶切位點,酶切后成1條帶,大小約為7 600bp,與預期相符(見圖3)。

2.3重組病毒的純化及PCR鑒定

轉染產物接種6孔板后,約培養36h后出現空斑,在倒置熒光顯微鏡下可以觀察到部分病毒噬斑發出強烈的綠色熒光,說明EGFP基因在重組的PRV中獲得表達,從而證實所構建的轉移載體是可行的。用原始毒株和經過3次純化的重組病毒的基因組DNA為模板,用Ps、Pa檢測引物擴增TK缺失片段,原始毒株得到627bp的片段,而重組病毒株為陰性,證實已得到均一的重組病毒(見圖4)。

用重組病毒的基因組DNA為模板,Ps-EGFP、Pa-EGFP為引物PCR擴增EGFP基因中2 047～2 253之間長206bp的片段,結果與預期一致,表明EGFP基因確實已經插入到PRV-Ra株的基因組中(見圖5)。

3討論

TK基因是偽狂犬病病毒的主要毒力基因,它與病毒在細胞中的增殖無關,TK基因缺失后的病毒同野毒株一樣在細胞培養上增殖良好,但毒力和潛伏感染的能力大大降低[5]。本研究以PRV TK基因為基礎,通過擴增其同源重組左右臂,缺失203bp的基因片段,這一缺失涉及到PRV中較為保守的序列,因此將影響到TK的功能,從而降低病毒毒力。

通過同源重組來產生重組病毒是一種廣泛使用的構建重組病毒的方法,但如果沒有有效的篩選標記,工作量將非常大,要獲得重組病毒將是非常困難的。為了克服這一問題,本研究將一種全新的報告基因——增強型綠色熒光蛋白EGFP基因插入載體PUC19/HEK-TK中用以篩選重組病毒。EGFP基因可實時表達,無需另外增加底物或輔助因子協作指示,如果病毒發生重組,在倒置熒光顯微鏡下就可以觀察到明亮的綠色熒光,大大簡化了篩選過程。

本試驗用酶切的方法將帶有pcDNA 3.0整套真核表達元件(CMV啟動子、多克隆位點區、BGH的Poly A信號序列)的基因的片段切下來,用平末端連接的方法插入到PUC19/HEK-TK載體中,得到轉移載體PUC19TK-EGFP。這樣控制外源基因表達的啟動子是CMV,CMV是一個適于在哺乳動物細胞中表達的高效啟動子。試驗也表明,將轉移載體與病毒基因組共轉染BHK細胞后,綠色熒光蛋白EGFP基因在CMV啟動子的驅動下獲得了穩定表達,同時也證實該通用轉移載體的有效性,這為下一步構建表達其他病毒的重組疫苗提供了理論基礎。

本試驗通過酶切、補平的方法消除了pUC19中的Hind Ⅲ/EcoRⅠ/KpnⅠ等3個酶切位點,使EGFP表達盒中引入了1個常用的限制性內切酶的多克隆位點,構成通用轉移載體PUC19-TK/EGFP,將來可以用1個或多個外源基因置換EGFP基因,進行多基因重組,從而產生“一針防治幾病”的多價基因工程苗。

4參考文獻

[1] 殷震,劉景華. 動物病毒學(第二版)[M].北京:科學出版社,1997.

[2] 錢平,李祥敏,陳煥春,等.偽狂犬病毒通用轉移載體的構建及應用[J].中國預防獸醫學報,2003,25(1):16-20.

[3] 方六榮,周復春,陳煥春,等.偽狂犬病毒鄂A株TK-/LacZ+突變株的構建[J].畜牧獸醫學報,2001,32(3):244-248.

[4] 周復春.偽狂犬病基因缺失苗的構建[D].武漢:華中農業大學,1998.

[5] 陳煥春,周復春,方六榮,等.偽狂犬病病毒鄂A株TK-/gG-/LacZ+突變株的構建[J].病毒學報,2001,17(1):69-74.