α－酮戊二酸鹽對釀醋廢水厭氧發酵產沼氣的影響

王　志　許　櫻　陳　雄　廖文談　王金華　李冬生

摘要釀醋廢水接種活性污泥后在厭氧、37℃和120rpm條件下進行批培養,添加α-酮戊二酸鹽(終濃度0.2g/L)促進甲烷菌的三羧酸循環碳代謝和胞內的鎳同化作用,使同化鎳含量比對照提高53.2%,這反映了以鎳為中心離子的F430的合成和以F430為輔酶的甲基CoM還原酶活性得到增強,并最終從產氣效率上反映出來,其添加α-酮戊二酸鹽(終濃度0.2g/L)揮發性乙酸鹽殘留量比對照減少27.3%,而沼氣總產量、TS和YP/V以及qp分別比對照提高了23.0%、11.1%、20.1%和10.7%,說明厭氧體系中添加α-酮戊二酸鹽可以促進食醋廢水中的乙酸底物代謝流向終產物甲烷而非僅用于菌群繁殖,α-酮戊二酸鹽是通過提高菌群的甲烷合成能力來提高產氣,而非僅通過促進菌群生長的群體優勢。

關鍵詞α-酮戊二酸鹽;厭氧發酵;沼氣;代謝

中圖分類號X797文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)15-0280-02

Effectofα-ketoglutarateonAnaerobicBatchMethaneFermentationofVinegarBrewingWastewater

WANG Zhi 1,2,3XU Ying1,2,3 CHEN Xiong 1,2,3LIAO Wen-tan1,2,3 WANG Jin-hua1,2,3 *LI Dong-sheng1,2,3

(1 College of Bioengineering,Hubei University of Technology,Wuhan Hubei 430068; 2 Key Laboratory of Fermentation Engineering(Minister of Education); 3 Hubei Provincial Key Laboratory of Industrial Microbiology)

AbstractThe effect of α-ketoglutarate on anaerobic batch methane fermentation of vinegar brewing wastewater was investigated at 37℃ and 120rpm. The results showed that α-ketoglutarate addition of 0.2g/L facilitated carbon metabolism of TCA cycle and assimilatory Ni in methan-ogenesis,thus enhancing assimilatory Ni concentration that was 53.2% higher than control,which reflected the improvements of F430 biosynthesis with Ni as central metal ion,and suggested the enhancement of methylreductase with coenzyme of F430. The 27.3% lower residually volatile acetate,the 23%、11.1%、20.1% and 10.7% higher biogas,TS,YP/V and qp suggested anaerobic vinegar brewing wastewater fermentation with α-ketoglutarate addition facilitated biogas production not only by increasing microorganism amounts,but also by enhancing the ability of methanogens to biosynthesize methane.

Key wordsα-ketoglutarate;anaerobic fermentation;biogas;metabolism

食醋釀造生產過程中產生大量高濃度有機廢水,其有機物和懸浮物含量高[1],排放會導致受納水體富營養化。國內處理廢水的工藝主要包括厭氧水解-好氧處理方式以及活性污泥污水處理[2]。由于以乙酸為底物所形成的甲烷約占總量的60%[3],因而用釀醋廢水厭氧發酵產沼氣有其潛在的應用價值和環保價值。厭氧發酵產沼氣過程是產甲烷菌利用底物水解和產酸階段所生成的乙酸等簡單底物合成CH4等混合氣的過程[4],包括不產甲烷細菌為產甲烷細菌提供生長和產甲烷所需要的基質以及適宜的氧化還原電位條件,產甲烷細菌又為不產甲烷細菌的生化反應解除了反饋抑制等[5]。因此,能夠影響混合菌群代謝活性以及改變其代謝狀態的因素會對產甲烷菌的活性和產氣效率產生顯著影響[6]。現主要考察α-酮戊二酸鹽對釀醋廢水厭氧發酵的影響,并由此探討厭氧菌群的代謝反應以及提高產氣率、降低運行成本的有效模式。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1發酵培養基配方。釀醋廢水為自配水,配方為:NH4Cl 1.0g/L,MgCl2 1.0g/L,KH2PO4 0.4g/L,Yeast extract 1.0 g/L,Peptone 2.0g/L,Na2S 0.2g/L,CH3COONa 5.0g/L,微量元素液10mL。微量元素終濃度為:FeCl2 0.9g/L,H3BO3 0.06g/L,ZnCl2 0.07g/L,CuCl2 0.01g/L,MnCl2 0.06g/L,CoCl2·6H2O 0.12 g/L,NiCl2·6H2O 4.8g/L,Na2SeO3 0.02g/L,Na2WO4 0.03 g/L,Na2MoO4·2H2O0.025g/L。

1.1.2接種物。活性污泥采自黃石檸檬酸廠污水處理車間。

1.1.3試驗裝置。采用橡皮塞封口的250mL抽濾瓶作為反應器,上口連接硅膠管進入集氣系統,在(37±1)℃的恒溫搖床進行批次發酵。

1.2試驗方法

1.2.1發酵體系裝配。配制培養基150mL,接種30mL,接種污泥液后,體系pH值調至7.0,并用氮氣(純度為99.9%,并經除氧銅柱除氧)進行體系氣體置換15min,橡膠塞密封后放入恒溫搖床培養,出氣管固定于15% NaOH水溶液置換瓶。搖床轉速120rpm。

1.2.2分析檢測方法。①產沼氣量檢測。采用水壓法收集發酵產生的氣體,根據排出15% NaOH溶液的體積定時記錄各套裝置的產氣量。②發酵液pH值及揮發性脂肪酸檢測。定時取樣后立即用pH計測定pH值。揮發性脂肪酸(VFA)的檢測參照文獻[7]進行。③總固形物(TS)含量及鈷含量檢測。TS含量:樣品8 000rpm離心15min,超純水充分洗滌,重復3次,置于105℃烘箱至恒重。TS用超純水充分洗滌,鎳濃度采用原子吸收光譜法檢測,方法參照文獻[8]進行。

2結果與分析

2.1α-酮戊二酸鹽對釀醋廢水厭氧發酵產氣的影響

不同α-酮戊二酸鹽添加量對厭氧培養96h的最終產氣量的影響如圖1所示。由圖1可知:產氣量隨其添加濃度的增加而提高,0.2g/L添加量產氣最高,比對照提高23.0%,但是當添加量繼續增大(如0.3g/L)時,產氣量下降,比0.2g/L添加量減少15.2%。因此,發酵結束后,對對照組和0.2g/L添加組樣品進行了檢測,以進一步研究α-酮戊二酸鹽對釀醋廢水厭氧發酵產沼氣影響的機理。發酵指標如表1所示。

由表1可知:添加α-酮戊二酸鹽(試驗組)厭氧發酵96 h的TS比對照提高了11.1%。說明α-酮戊二酸鹽的添加促進了厭氧菌群的生長。釀醋廢水中的乙酸可以作為底物被厭氧菌群用于繁殖和合成CH4,其殘留量(試驗組)為0.24g/L,比對照減少27.3%,這也反映出更多的乙酸鹽底物被菌群利用,并引起pH值的提高,發酵結束時,比對照提高了4%。初步判斷添加α-酮戊二酸鹽可以促進VFA向固形物質(TS)和沼氣的轉化。乙酸鹽底物轉化效率的得率系數YP/V是484mL/g(試驗組),比對照提高了20.1%。沼氣的比生成速率qp說明單位菌群的沼氣合成能力,試驗組為7.04mL/g·h,比對照增加了10.7%,說明高產氣效率是通過提高菌群的甲烷合成能力來提高,而非僅通過促進菌群生長的群體優勢。

從代謝的角度分析,甲烷菌具有特殊的代謝網絡,如:不完整的三羧酸循環代謝途徑[9]。甲烷菌具有運輸四碳、六碳二羧酸等有機物進入細胞的轉運蛋白[10]。因此,外源α-酮戊二酸鹽可能參與三羧酸循環代謝,經代謝生成更多的琥珀酰CoA,而該物質是F430從頭合成的前體物質之一[11]。甲烷合成最后一步是在甲基輔酶M 還原酶的催化下最終形成甲烷。而F430是甲基輔酶M還原酶的輔酶[12]。且F430是含鎳的四吡咯衍生物[8],鎳的充分供給與同化是甲烷高效合成必需的條件[13]。此外,對于嚴格厭氧發酵而言,電子需要在鎳鐵硫電子載體的參與下,把電子傳遞給產甲烷過程中需要電子還原的反應[14]。因而厭氧體系中同化于厭氧菌群的鎳可以反映出甲基輔酶M還原酶的活性以及甲烷合成效率。

2.2α-酮戊二酸鹽對釀醋廢水厭氧發酵體系鎳同化的影響

由圖2可知,添加α-酮戊二酸鹽使體系同化的鎳含量為113.6μg(Ni)/g(TS),比對照提高了53.2%。說明其促進了三羧酸循環的碳代謝,提高了細胞對鎳的需求和甲烷菌群胞內的鎳同化作用,促進了F430的合成以及甲烷合成電子傳遞效率和甲基輔酶M還原酶的活性,并最終從產氣效率(YP/V、qp)上反映出來。

3結論

試驗結果表明,外源α-酮戊二酸鹽促進釀醋廢水厭氧發酵產沼氣,以0.2g/L添加量產氣最高,比對照提高23.0%,TS比對照提高了11.1%,而揮發性乙酸鹽殘留量比對照減少27.3%,說明α-酮戊二酸鹽添加促進厭氧體系總固形物TS增加,促進揮發性脂肪酸VFA向固形物質(TS)和沼氣的轉化。α-酮戊二酸鹽的存在使YP/V和qp分別比對照提高20.1%和10.7%,說明高產氣效率是通過提高菌群的甲烷合成能力來提高,而非僅通過促進菌群生長的群體優勢。添加α-酮戊二酸鹽后,促進甲烷菌三羧酸循環的碳代謝,促進了甲烷菌群胞內的鎳同化作用,使同化鎳含量相對于對照提升了53.2%,并最終從產氣效率上反映出來。

4參考文獻

[1] 羅志騰.高濃度釀造廢水治理方案選優[J].中國給水排水,1992,8(5):27-30.

[2] 傅鴻運.活性污泥污水處理方法[J].中國釀造,1999(6):36-38.

[3] GALAGAN J E,NUABAUM C.The genome of M. acetivorans reveals extensive metabolic and physiological diversity[J].Genome Res,2002(12):532-542.

[4] WU J H,LIN C Y. Biohydrogen production by mesophilic fermentation of food wastewater[J]. Wat Sci Technol,2004(49):223-228.

[5] STAMS A J.Metabolic interactions between anaerobic bacteria in methanogenic environments[J].Antonie Van Leeuwen-hoek,1994(66):271-294.

[6] STAMS A J.Evidence for H2 and formate formation during syntrophic degradation of butyrate and propionate[J]. Anaerobe,1995(1):35-39.

[7] 任南琪,王愛杰.厭氧生物技術原理與應用[M].北京:化學工業出版社,2004.

[8] HU Q H,LI X F,CHEN J. Effect of nitrilotriacetic acid on batch methane fermentation of sulfate-containing wastewater[J]. Process Biochem,2008(43):553-558.

[9] HENDRICKSON E L,KAUL R.,ZHOU Y,et al. Complete genome sequence of the genetically tractable hydrogenotrophic methanogen Methanococcus maripaludis[J]. J bacteriol,2004(186):6956-6969.

[10] 單麗偉,馮貴穎,范三紅.產甲烷菌研究進展[J].微生物學雜志,2003(23):42-46.

[11] 趙春輝,穆江華,岑沛霖.化學法與生物轉化合成5-氨基乙酰丙酸的研究進展[J].農藥,2003,42(11):11-15.

[12] HU Q H,LI X F,LIU H. Enhancement of methane fermentation in the presence of Ni2+ chelators[J]. Biochem Eng J,2008(38):98-104.

[13] ZHANG Y S,ZHANG Z Y,SUZUKI K,et al. Uptake and mass balance of trace metals for methane producing bacteria[J].Biomass and Bioenergy,2003(25):427-433.

[14] DEPPENMEIER U. The membrane-bound electron transport system of Methanosarcina Species[J]. J Bioenerg Biomembr,2004,36(1):55-64.