番鴨小鵝瘟病毒云浮株的分離與鑒定

周　全　宋永峰　周　麗　黎　敏　高　恒　宋延華　溫納相

【摘要】2008年初, 廣東云浮思勞片區番鴨養殖場出現下痢、張口呼吸、腳軟、堆積、采食量減少等癥狀。發病后的前3天曾經用過抗生素治療,但沒有效果,死亡率高達80%。病理解剖主要表現為腸道中后段膨大約3倍、整個腸道出血嚴重 ,有凝固性栓子。肝臟腫大,膽囊明顯膨大,腎臟腫脹。為查明原因,筆者對發病的雛鴨進行病毒的分離與鑒定工作,通過病毒分離、PCR、瓊脂擴散和動物回歸試驗證實獲得1株番鴨小鵝瘟病毒。經番鴨胚接種、雛番鴨攻毒試驗,證實所分離的病毒具有較強的致病性。

【關鍵詞】番鴨 小鵝瘟病毒 分離鑒定

小鵝瘟是由鵝細小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的1-5周齡雛番鴨和雛鵝的一種急性或亞急性、高度接觸性傳染病[ 1 ]。該病最早由我國著名學者方定一于1956年首次發現[ 2 ],并于1961年在鵝胚中分離到該病毒,目前已呈世界性分布[ 3 ]。臨診癥狀表現為雛番鴨纖維素性腸炎、小腸后段內容物形成臘腸樣栓子及肝、腎、心等實質臟器的炎癥,可引起雛番鴨20%-90%的死亡率,是嚴重危害番鴨養殖的重要病毒病[ 4 ]。本研究對一份疑似番鴨小鵝瘟病料進行了病毒分離鑒定,現將結果匯報如下:

1.材料與方法

1.1 材料

疑似番鴨小鵝瘟病料采自廣東省云浮市某番鴨場,健康非免疫番鴨胚和雛番鴨均由思勞孵化廠提供,標準陽性毒株由本室保存,陽性血清由動物防疫站惠贈。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀與剖檢變化 雛番鴨死前腹瀉嚴重,糞便呈褐色,瀕死期角弓反張,個別有神經癥狀。經剖檢可見整個腸道充血、出血嚴重;腸道后段有栓子,肝、膽囊腫大充血、淤血。

1.2.2 病料的處理 無菌采取疑似感染小鵝瘟瀕死病番鴨的肝臟、腎臟和脾臟,將病料剪碎研磨后,按1∶3比例加入生理鹽水,制成懸液。-70℃/37℃反復凍融3次,10000r/min離心10min,取上清,過濾除菌后-20℃保存備用。

1.2.3番鴨胚接種 取上述病毒液以尿囊腔途徑接種12日齡健康非免疫番鴨胚10枚,每枚0.2mL,同時設生理鹽水及空白對照組。37℃培養,每日觀察番鴨胚發育和死亡情況,棄去24h內死亡胚,無菌收集接種后3～7d死亡的番鴨胚和活胚的尿囊液,經無菌檢驗后,低溫保存備用,同時取出胚體觀察其病理變化。

1.2.4鴨胚成纖維細胞培養 按常規方法制備鴨胚原代成纖維細胞(DEF),當DEF長至70%～80%單層時,將GPV病毒液接種于細胞中,37℃培養,觀察細胞病變。

1.2.5瓊脂擴散試驗 按常規方法應用標準陽性血清和分離病毒的番鴨胚尿囊液進行瓊脂擴散試驗。

1.2.6 PCR檢測 根據參考文獻合成小鵝瘟檢測引物,常規方法提取樣品DNA,進行PCR檢測;目的片段約為600bp。

1.2.7病毒致病性測定 將80只雛番鴨隨機分成8組。前7組分別注射10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7倍稀釋含小鵝瘟病毒的番鴨胚尿囊液,接種量為肌注0.2mL/只,第8組為對照組。分別隔離飼養,連續觀察,記錄死亡情況。按Reed-Muench法計算LD50。

1.2.8動物回歸試驗 將20只12日齡雛番鴨隨機分為2組,每組10只,一組為試驗組,肌注0.5 mL/只分離的病毒,另一組肌注0.5mL/只生理鹽水作為對照組,相同條件下隔離飼養,觀察15天。

2 結果與分析

2.1 剖檢變化

2.2番鴨胚接種試驗 將待檢病料接種于10只番鴨胚,24h內沒有發現番鴨胚死亡,番鴨胚在24h-96h死亡8枚。胚體觀典型的病變主要為絨毛尿囊膜水腫,有灰白色針尖狀小點;胚體充血、出血;喙、趾、頸部皮膚等均有明顯出血點;肝臟充血,心肌、后腦出血,頭、頸部及兩肋皮下有水腫,出現小鵝瘟臨床癥狀和剖檢特征。結果見圖3。

2.3鴨胚成纖維細胞培養試驗 DEF接種病毒后,紡錘形的鴨胚成纖維細胞出現圓縮、脫落等明顯的病變,說明病毒能在番鴨胚原代細胞中增殖,結果見圖4、圖5。

2.4瓊脂擴散試驗 分別用標準陽性血清與培養的病毒進行瓊脂擴散試驗。中央孔為標準陽性血清,外周為6份培養病毒的番鴨胚尿囊液,每孔加入200uL,酒精燈封底后,置37℃濕盒中,溫育48h后,觀察結果,可見6份尿囊液均與標準陽性血清形成明顯的沉淀線,結果見圖6。

2.5 PCR檢測 按照參考文獻的方法進行PCR擴增,電泳結果可見到清晰的目的條帶,即GPV PCR陽性,見圖7。

1:陽性對照、2:陰性對照、3:分離毒株、M:marker2000

2.6病毒致病性測定

將不同稀釋度的含病毒的番鴨胚尿囊液接種健康非免疫番鴨后,連續觀察9d,記錄死亡情況,用Reed-Muench法計算。

從下表可以看出,該毒株的LD50在10-4和10-5之間,按公式計算(62- 50)/(62- 33)=12/29=0.4,根據統計學的方法得出分離毒株的LD50= 10-4.6/0.2mL。

2.7動物回歸試驗結果

接種含毒尿囊液的雛番鴨于接種后第5天開始出現癥狀,接毒組出現輕微的腹瀉、不愿走動、精神萎頓、食欲減退;后期嚴重腹瀉,呼吸困難,兩腳麻痹,行走困難,臥地不起,發病率為100%。

剖檢可見小腸粘膜充血或出血,肝臟稍腫大,呈深紫色,表面有出血點;膽囊明顯膨大,充滿暗綠色膽汁;腸粘膜彌散性出血,腸道尤其是靠近回盲部的腸段呈現典型的卡他性、纖維素性、壞死性腸炎的變化,質地堅實,似香腸樣,壞死的腸粘膜、滲出的纖維素等凝固形成的栓子。陰性對照組的10只雛番鴨正常。

3. 小結和討論

3.1 盡管小鵝瘟病毒的血清型只有一種,其自然感染宿主也只有雛番鴨和雛鵝, 但近年來研究發現不同地區分離毒株毒力不同[ 8,9 ], 使該病難于預防和治療, 這也是常規疫苗的免疫保護失敗的主要原因[ 11 ]。

3.2 本試驗分離的小鵝瘟地方株能使番鴨胚產生特征性病變;在動物回歸試驗中, 可使雛番鴨出現典型小鵝瘟癥狀;本病毒能被小鵝瘟陽性血清中和;分離毒株這些特性與鵝細小病毒一致, 確認所分離病毒株為鵝細小病毒[ 12 ], 該病毒是雛番鴨和雛鵝疫病的主要病原之一, 對番鴨養殖業危害極大[ 13 ]。

參考文獻:

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[ 10 ] 趙愛玲. 小鵝瘟的診斷及病毒分離鑒定[J] . 畜牧獸醫科技信息,2005 ,11 :91.

[ 11 ] 陳曉月,趙承輝,劉爽. 小鵝瘟地方株的分離鑒定及致病力試驗[J] . 沈陽農業大學學報,2007 ,38 (3) :410 - 412.

[ 12 ] 吳繼秋,李東華,金紅范等. 小鵝瘟病毒的分離與初步鑒定[J] . 延邊大學農學學報,2005 ,3 (1) :26 - 30.

[ 13 ] 李云龍,于 剛,姜鳳華等. 小鵝瘟病原分離及鑒定[J] . 現代畜牧獸醫,2008 ,3 :39 - 40.

作者簡介:周全(1982-),男,湖北黃岡人,本科,現于廣東溫氏食品集團研究院工作,主要從事禽病相關研究工作。