ＡＴＰ在大鼠胰島分離中的保護作用研究

溫壽青　邱　立　汪春福　鄒桂華

【摘要】 目的 探討三磷酸腺苷（ATP）在大鼠胰島分離過程中抑制胰酶對胰島細胞的消化作用。方法 將20只SD大鼠平均分為兩組，處理組在胰島分離全過程中加用ATP進行干預，對照組則不加ATP處理，采用Ficoll非連續密度離心純化后對兩組胰島細胞的凋亡、胰島產量及活力方面進行比較性研究。結果 加用ATP的處理組的胰島細胞凋亡率顯著低于對照組(P<0.01),處理組胰島產量和胰島素釋放水平均顯著高于對照組（P<0.01）。結論 胰島分離過程中加用一定濃度ATP對胰島具有抑制凋亡和保護胰島活力的作用。

【關鍵詞】

胰島分離；ATP；流式細胞儀；凋亡

Protective effect of ATP in rat islets isolation

WEN Shou-qing,QIU Li,WANG Chun-fu,et al.Baoan Peoples Hospital,Shenzhen 518101,China

【Abstract】 Objective To observe the anti-apoptosis effect of ATP in rat islets isolation.Methods The rats were devided into 2 groups according whether with the treatment of ATP during the islets isolation.The purified islets by Ficoll were compared between the groups.Results The outcome and anmouts of insulin release under the glucose stimulating of isolated and purified islets in ATP group were superior to those in the control group(P<0.01).The number of apoptosis islet cells in ATP group were fewer than those in control group(P<0.01).Conclusion With the treatment of ATP during the islets isolation may protect the islets from trypsin digestion and prevent apoptosis of islet cells.

【Key words】 Islet isolation; ATP; Flow cytometer; Apoptosis

胰島移植通過β細胞替代療法治療1型糖尿病，近年來成為研究的熱點［1］。但與其他移植治療一樣，供體來源的短缺仍是人同種異體胰島移植在臨床廣泛開展所面臨的重大困難,而目前大多數的臨床胰島移植需要2~3個供體胰腺分離所獲的胰島量來達到完全脫離胰島素依賴的效果［2］。一個主要原因是在胰島分離純化過程中缺氧引起胰島細胞的凋亡和死亡［3］，，影響了移植胰島的質量。本實驗直接針對缺氧這個重要的損傷因素，在整個移植前處理過程中加用三磷酸腺苷（ATP）對胰島進行保護，觀察其對胰島損傷，特別是在細胞凋亡過程中所產生的影響和效果。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑 膠原酶V，由SIGMA公司提供；分散酶Dispase Ⅱ由美國羅氏公司提供；TUNEL凋亡檢測試劑盒由南京凱基生物科技發展有限公司提供；Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒有Biovision公司提供；大鼠胰島素ELISA試劑盒由Mercodia公司提供。

1.2 動物來源、分組和處理SD大鼠，雌雄不限，體質量250~300 g，由廣東中醫藥大學實驗動物中心（動物合格證號：NO.0010321）提供。20只大鼠隨機分成兩組,ATP處理組10只，在胰導管逆行注射膠原酶時加用ATP注射液2 ml，20 mg。對照組10只，處理過程中不加ATP，等量生理鹽水代替。

1.3 胰島的分離和純化 實驗大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，無菌術下正中線開腹，結扎胰膽管近肝端，皮試注射器胰管逆行注射1.5 mg/ml膠原酶溶液10 ml，使胰腺充分膨脹，取下整個胰腺后剪碎，37℃水浴消化10 min后，加入含20%小牛血清的Hanks液終止消化，不銹鋼濾網過濾，Hanks液洗滌離心2次。ATP處理組在整個分離過程中的Hanks液中均加用ATP(5000 U/ml)處理。

胰島純化采用Ficoll400不連續梯度離心法。將分離后的沉淀物加入25%的Ficoll400溶液4 ml，充分混勻后，在液層上依次加入23%,20%，10%的Ficoll400溶液，2000轉/min低溫離心15 min后，吸取23%，20%兩層之間以及20%，10%兩層之間的胰島，Hanks液洗離心2次。用含20%小牛血清的RPMI-1640培養液收集胰島。

1.4 胰島產量計數 純化后的胰島用雙硫腙（DTZ）染色。用定量加樣器在胰島懸液中取樣3次，每次50 μl鏡檢DTZ染色陽性細胞團，按以下公式［4］計算胰島量：胰島數=3次細胞團總數÷3×20×樣本總體積（ml）。

1.5 原位末端核苷酸標記法（TUNEL）觀察胰島細胞凋亡 將純化后的胰島細胞或細胞團接種于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，按上述實驗分組處理，自然干燥后，加2%多聚甲醛固定1 h，PBS漂洗5 min，浸入3%雙氧水/甲醇溶液中室溫封閉10 min,阻斷內源性過氧化物酶。然后浸入0.1%TritonX-100室溫處理 10 min，PBS洗3次。加TdT酶反應液37℃避光反應60 min,PBS漂洗后滴加Streotavidin-HRP工作液，避光反應30 min后，滴加DAB顯色，室溫避光反應15 min，PBS漂洗后直接光學顯微鏡下觀察拍照。

1.6 Annexin-V/PI定量分析胰島細胞凋亡率 純化后的胰島懸液中加入2 ml分散酶Dispase Ⅱ，37℃水浴搖床消化15 min，18G針筒抽吸數次，獲得胰島單細胞懸液獲得含20%小牛血清的RPMI-1640培養液8 ml中止消化。用無血清的RPMI-1640培養液洗2次，收集細胞記數，調整細胞濃度為106/ml,對照管和檢測管每管各加100 μl細胞懸液，每管分別加5 μl PI和Annexin V-FITC抗體，避光室溫孵育10 min后，美國Coulter公司ATRLA型流式細胞儀檢測分析。

1.7 流式細胞儀對Bcl-2/Fas-L表達水平的檢測 制備胰島單細胞懸液，調整細胞濃度為106/ml，加入Fixation劑100 μl,固定15 min,加入PBS1 ml清洗1次,離心后再用PBS清洗1次，將上面細胞分成兩管,一管加入同性對照,一管加入Bcl-2及Fas-L一抗試劑1 μg,在避光孵育15 min。用PBS清洗1次,加入二抗FITC 10 μl試劑,避光孵育15 min,用PBS清洗1次,將樣本放置在流式細胞計數儀上檢測,采用SystemⅡ軟件系統進行分析。

1.8 葡萄糖刺激胰島素釋放實驗檢測胰島功能 純化后的胰島經Hanks液洗滌3次，分別轉移至無糖，低糖（2.7 mmol/L）和高糖（16.7 mmol/L）無血清RPML-1640培養基中，每孔100個胰島，于37℃,5%CO₂培養箱內培養2 h，收集培養液，用大鼠胰島素ELISA試劑盒進行檢測，測定培養液中的胰島素水平。

1.9 統計學方法 計量資料均以均數±標準差(x±s)表示。使用SPSS 11.5軟件，采用兩個樣本t檢驗及兩組樣本率比較的秩和檢驗，P<0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ATP處理對胰島產量的影響 分離純化后的胰島數量，ATP處理組的胰島產量（312.3±6.2）個較對照組（306.5±5.6）個之間差別無統計學意義(P>0.05)。

2.2 原位末端核苷酸標記法檢測胰島細胞凋亡 胞核呈深棕色的陽性細胞為凋亡細胞。光鏡下觀察結果顯示,處理組的陽性細胞數量明顯少于對照組。見圖1：

2.3 Annexin V/PI雙染色檢測胰島凋亡結果 通過流式細胞儀定量檢測胰島細胞凋亡，結顯示ATP處理組的平均細胞凋亡率為(8.6±2.9)%,而對照組為（22.7±3.1）%,處理組的胰島細胞凋亡率明顯低于對照組（P<0.01）。見圖2。

M1表示細胞碎片和部分死亡細胞比例，M2表示死亡細胞比例，M3表示活細胞比例，M4表示凋亡細胞比例。說明：三個散點圖橫軸的4個坐標從左到右分別為：100，101，102，103三個散點圖縱軸的4個坐標從下到上分別為：100，101，102，103

2.4 Bcl-2/Fas-L表達水平的檢測結果 ATP處理組Bcl-2的陽性率（20.8±1.1）%較對照組陽性率（9.7±1.7）%顯著升高（P<0.01）,同時處理組Fas-L的陽性率（6.2±0.9）%與對照組陽性率（15.6±2.1）%比較顯著性降低（P<0.01）。

2.5 葡萄糖刺激胰島素釋放實驗檢測結果 ATP處理組在低濃度葡萄糖和高濃度葡萄糖刺激下釋放胰島素水平均顯著高于對照組（P<0.01），在無葡萄糖刺激下兩組釋放胰島素水平無顯著性差異（P>0.05），見表1。

3 討論

胰島從生物學特性上看是相當脆弱的細胞團,外界微環境的變化對它形態結構的完整和功能的保持都有著顯著的影響。如何提高供體胰島的數量與質量是近年來研究的一個重要方面。目前的臨床胰島移植，在供體胰島的分離純化過程中，存在很多對胰島損傷的因素，比如機械力的損傷，缺氧，滲透壓的改變，純化介質對胰島的毒性作用，外分泌部腺泡釋放出的胰酶，組織因子［5］等，都會對分離出的胰島造成損害，或使胰島團內的細胞死亡，或是激活凋亡程序。有研究用早期凋亡檢測法證明，在移植前的胰島處理過程中，一部分胰島細胞的凋亡程序已經被啟動，事實上胰島進入受體后的命運，是否能抵抗不良因素而成功存活，在移植前就已經決定。而解決這個問題的重要途徑，就是在移植前的整個處理過程中如何對胰島進行保護［6-7］。

近年相關研究顯示，胰島自供體胰腺血流阻斷起即進入缺氧狀態，且在整個分離和培養過程中，直至移植后胰島細胞團內微循環重新建立前的一段時間，都無有效的氧供，缺氧可導致胰島細胞線粒體受損，ATP生成障礙，細胞正常生理活動受損，離子通道功能障礙，從而無法維持正常膜電位，胞質Ca2+濃度升高，細胞膜損傷和溶酶體損傷，由此引起細胞的死亡或凋亡。

根據以上情況，本實驗直接針對缺氧這個重要損傷因素，在整個移植前處理過程中對胰島進行保護。ATP是維持細胞生命重要的能量物質，細胞微環境內ATP大量缺失將導致細胞死亡。本實驗設計的保護因素ATP-MgCl₂是臨床常用的能量劑和輔酶類藥物，可透過細胞膜進入細胞，直接為細胞提供能量,維持細胞正常形態，膜電位，以及維持正常生命活動必需的蛋白質合成功能，且ATP可促進胰島素的合成，有利于維持和提高待移植胰島的功能。

實驗結果顯示ATP處理組的胰島產量較對照組并無顯著差別，但胰島素釋放實驗顯示實驗組的胰島對葡萄糖刺激的反應能力優于對照組，提示ATP對胰島的功能具有保護作用。

有研究表明胰島細胞的凋亡是引起胰島功能損傷的一個重要因素［10］。為進一步研究ATP對分離胰島的保護作用機制，本實驗特別通過TUNEL以及流式細胞儀對胰島細胞凋亡的進行檢測。結果表明，ATP處理組胰島細胞的凋亡得到有效控制，細胞凋亡率下降，提示ATP在分離胰島過程中具有抑制胰島細胞凋亡的作用，對胰島功能的損害起到了抑制效果，從而對胰島的活力具有保護作用。而通過對凋亡相關基因表達的檢測，進一步提示了ATP對胰島凋亡的抑制作用可能是通過促進凋亡抑制基因Bcl-2的表達和抑制凋亡基因Fas-L的表達而實現的。但是對ATP細胞毒性研究顯示，ATP同時還具有誘導細胞凋亡的作用［11］，其機制主要與多個嘌呤受體激活有關，包括：P2X₁、P2X₂、P2X₇等。不過近年來的研究顯示，雖然ATP對細胞凋亡具有雙重作用，但其對產生細胞保護作用的濃度要低于誘導凋亡的濃度很多倍，所以對ATP的濃度控制很重要。另一方面相關研究證明，在胰島β脈內留置時間長且不易穿破血管壁等優勢在臨床上得到廣泛應用，為了觀察BD密閉式靜脈留置針在血漿置換術中應用的臨床效果，筆者對2005-2008年間，共236例內科系統疾病需行血漿置換的患者， 隨機分為BD密閉式靜脈留置針組和細胞中ATP對胰島素的分泌起著重要的調節作用［12］，故選擇ATP5000 U/ml濃度，在細胞靜息狀態下，ATP通過動員胞內鈣庫的Ca+釋放使胞漿鈣離子濃度顯著增加，觸發β細胞強烈分泌胰島素。這就能進一步解釋ATP處理組胰島對葡萄糖刺激釋放胰島素量高于對照組的實驗結果。

綜上所述，本實驗提示在胰島分離過程中使用一定濃度的ATP可以起到保護胰島，抑制胰島細胞凋亡，提高胰島質量的作用。因此有希望成為一種提高臨床胰島移植中供體胰島分離純化效果的有效途徑。目前需進一步采用大動物實驗及更進一步胰島細胞凋亡觀察。

參 考 文 獻

［1］ Jason L.G,AM..Shapiro,Gordon CW.Islet transplantation:progress and challenge.Achieves of medicalresearch,2005,36:274.

［2］ OlleKorsgren,B.Nilsson,C.Berne,et al.Current status of clinical islet transplantation.Transplantation,2005,79:1289.

［3］ Gray DWR.Avoiding damage transplanted human islets during implantation is important.Transplantation,2005,79:1294.

［4］ 董維平，張洪德，王煜非，等.胰島移植物質量鑒定方法的研究.中華器官移植雜志，1998，19:205.