羅格列酮對(duì)體外高糖培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

[摘要] 目的 探討羅格列酮對(duì)體外高糖培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法 SD乳鼠進(jìn)行原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)48h后，換無血清的DMEM培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到24孔板上，隨機(jī)分為3組，分為培養(yǎng)心肌細(xì)胞不加入葡萄糖組，加入25mmol/L葡萄糖組，加入25mmol/L葡萄糖以及10μmol/L羅格列酮組。48h后，分別測(cè)定各組心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶含量;四唑鹽比色法測(cè)定各組心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及增殖活性;流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比較，經(jīng)過羅格列酮干預(yù)后，乳酸脫氫酶含量顯著下降;四唑鹽比色結(jié)果顯示心肌細(xì)胞存活率增高;流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞明顯減少。結(jié)論 羅格列酮能夠抑制體外高糖培養(yǎng)的乳鼠心肌的細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 心肌細(xì)胞; 細(xì)胞凋亡; 損傷; 糖尿病

[中圖分類號(hào)] R587.2;R542.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2009)23-19-03

The Effect of Rosiglitazone on High Glucose on the Cardiomyocytes Apopotosis in Cultured Neonate Rat

YU Hongyu MA Chunyu

The Graduate College of Liaoning Medical University，Liaoning 121001，China

[Abstract] ObjectiveTo investigate the effect of rosiglitazone on high glucose on the cardiomyocytesapopotosis in cultured neonate rat. MethodsAfter 48 hours cultured the primitive cardiomyocytes of Sprague-Dawley neonate rats，continuing to culture them in the DMEM medium without serum，changing culture fluid，tranfering them to the 24-holl-medium，were randomLy divided into 3 equal groups:the normal control group，the 25mmol/L glucose group，the 25mmol/L glucose and the 10μmol/L rosiglitazone group. The lactate dehydrogenase of the neonate rat cardiomyocytes were determined. At the same time，we determine the living rate of cardiomyocytes by MMT and we observe the cardiomyocytes apopotosis with the Flow Cytometer. ResultsCompared to the normal control group，in the rosiglitazone group，the lactate dehydrogenase of the neonate rat cardiomyocytes remarkablly decreased;the cell living rate obviously increased by MMT;the necrosis and apopotosis cells obviously reduced with the Flow Cytometer. ConclusionThe rosiglitazone could inhibit the apopotosis of the cultured cells of neonate rats remarkably.

[Key Words]Cardiomyocytes; Apopotosis; Injury; Diabetes

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者的一個(gè)嚴(yán)重并發(fā)癥。心肌細(xì)胞有不可再生的特點(diǎn)，且心肌細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致糖尿病心肌細(xì)胞丟失及心力衰竭的重要原因之一[1]。研究糖尿病時(shí)如何對(duì)抗心肌細(xì)胞凋亡具有重要意義，因此找到抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的途徑是防止DCM發(fā)生的重要手段。

國內(nèi)外臨床研究顯示，羅格列酮(rosiglitazone，RSG)可使空腹血糖(FPG)和糖化血紅蛋白(HbA1c)顯著下降，可改善血糖控制情況;同時(shí)伴有血胰島素和C肽水平降低，也可使餐后血糖和胰島素水平下降;其對(duì)血糖控制的改善作用較持久。唐曉紅[2]等研究發(fā)現(xiàn)RSG能夠使高糖刺激下的腎小管上皮細(xì)胞凋亡減少，并且有明顯的時(shí)效關(guān)系。但RSG對(duì)體外高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞是否具有抑制凋亡的作用報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)擬在體外模擬糖尿病時(shí)體內(nèi)高血糖環(huán)境，并研究RSG對(duì)高糖環(huán)境的心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley乳鼠，出生1～3d，雌雄不拘，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司)，Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)，XD-101型倒置顯微鏡(Olympus Tokyo JAPAN)，流式細(xì)胞儀(BD Facscalibur USA)，二氧化碳孵箱(Sheldon Manufacturing Inc USA)，羅格列酮原粉劑(史克必成天津制藥有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 在無菌的條件下，取出生2～3d的SD乳鼠，開胸取出心臟。用D-Hanks液沖洗三次后剪成約1mm³大小的碎片，加入0.08g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞。取消化完畢后的細(xì)胞，加入體積分?jǐn)?shù)為15%的小牛血清，84%的DMEM培養(yǎng)基，接種并于CO₂孵箱常規(guī)培養(yǎng)48h。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 將上述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到兩個(gè)24孔板上，隨機(jī)分為3組，每組16孔，換培養(yǎng)基的同時(shí)給藥，每組給藥如下，正常對(duì)照組:正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞，不加入葡萄糖;葡萄糖濃度為25mmol/L組;葡萄糖濃度為25mmol/L組+RSG10μmol/L組。給藥48h后，分別測(cè)定以下指標(biāo)。

1.2.3 乳酸脫氫酶含量的測(cè)定 取培養(yǎng)后心肌細(xì)胞的上清液，經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定乳酸脫氫酶活力，作為判斷心肌細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)。

1.2.4 四唑鹽比色法測(cè)定心肌細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖活性 各組細(xì)胞于測(cè)試前4h，每孔加入2mg/mL的MTT液(50μl/孔);于CO₂孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 0.15mL，充分振蕩10min后使結(jié)晶充分溶解，上酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度值(OD值)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)心肌細(xì)胞的凋亡率 流式細(xì)胞儀采用FITC- Annexin- V/PI雙染法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)分析，流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用488nm，用一波長(zhǎng)為515nm的通帶濾器檢測(cè)FITC(異硫氰酸熒光素)熒光，另一波長(zhǎng)大于560nm的濾器檢測(cè)PI(碘化丙啶)熒光。

將心肌細(xì)胞培養(yǎng)48h后用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106g/L，制成單細(xì)胞懸液，直接收集到10mL的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為(1～5)×106/mL，1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次，1000r/min離心5min。用100μl的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育15min。1000r/min離心5min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min，避光并不時(shí)振動(dòng)。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，可同時(shí)描述三群不同狀態(tài)細(xì)胞:左下象限FITC-/PI-細(xì)胞，即正?；盍?xì)胞;右下象限FITC+/PI-細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞;右上象限FITC+/PI+細(xì)胞，即已死亡細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多組間單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組乳酸脫氫酶含量及四唑鹽比色法結(jié)果

高糖刺激下，乳酸脫氫酶含量明顯增高，心肌細(xì)胞存活率明顯下降，而經(jīng)過羅格列酮干預(yù)后，乳酸脫氫酶含量下降，心肌細(xì)胞存活率明顯增高，各組之間比較具有顯著性差異(P<0.01)。見表1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

從流式細(xì)胞儀的雙變量散點(diǎn)圖上可以看出，正常對(duì)照組僅有少量的壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞;葡萄糖25mmol/L組可見較多的凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞;而經(jīng)過羅格列酮干預(yù)后，壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞明顯減少，但與正常對(duì)照組相比較，仍有一定的差異。見圖1、2、3。

3 討論

心肌細(xì)胞凋亡是產(chǎn)生糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的基礎(chǔ)。而判斷心肌細(xì)胞凋亡一般采用測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)含量較多的酶類、四唑鹽比色法測(cè)定心肌細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖活性、流式細(xì)胞儀檢測(cè)等方法。本研究顯示，體外培養(yǎng)的高糖干預(yù)下的心肌細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶含量增高，四唑鹽比色法結(jié)果顯示心肌細(xì)胞存活率降低，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示高糖培養(yǎng)下，壞死和凋亡的心肌細(xì)胞明顯增多。這些均說明高糖環(huán)境對(duì)體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞具有促進(jìn)凋亡的作用，同時(shí)也為后續(xù)進(jìn)行藥物干預(yù)的研究打下了前期基礎(chǔ)。

而羅格列酮(rosiglitazone，RSG)對(duì)體外高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞培養(yǎng)的干預(yù)后，LDH含量顯著下降;四唑鹽比色法結(jié)果顯示心肌細(xì)胞存活率顯著升高;流式細(xì)胞儀檢測(cè)的心肌壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞明顯減少。說明RSG在體外高糖環(huán)境下對(duì)心肌細(xì)胞的培養(yǎng)具有抑制乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用。進(jìn)而可以提示RSG對(duì)體外高糖培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

噻唑烷二酮類藥物有抑制細(xì)胞凋亡、增殖的作用[3]。RSG是其代表性藥物，它是一種新型的胰島素增效劑，通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(Peroxisome proliferators activated receptor-γ，PPAR-γ)而顯著改善2型糖尿病患者的胰島素抵抗，高胰島素、高脂血癥、高血糖癥而廣泛應(yīng)用于臨床。但其保護(hù)心肌細(xì)胞的作用可能存在其他機(jī)制:在體外實(shí)驗(yàn)中已證明RSG可以通過降低內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)的濃度而抑制心肌肥大[4]。大鼠心肌細(xì)胞有內(nèi)皮素特異性受體，在培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞中，ET-1可誘導(dǎo)心肌肥大、增加蛋白質(zhì)的合成，是引起心肌肥大的因子[5]。而RSG可能減少了隨后Na+/H+交換和Na+/Ca2+交換的激活，抑制鈣的內(nèi)流，減輕細(xì)胞的鈣超載，進(jìn)而抑制了ET-1引起的心肌肥大[6]。RSG還可以降低心肌細(xì)胞丙二醛含量，說明RSG可以抑制脂質(zhì)過氧化的作用，即RSG在高膽固醇血癥中保護(hù)心肌細(xì)胞的損傷可能與抗氧化作用有關(guān)[7]。此外RSG是胰島素的增敏劑，胰島素對(duì)心肌細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用[8]，因此RSG如果在體內(nèi)抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用將會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)。以上機(jī)制只是對(duì)RSG抑制心肌細(xì)胞凋亡的探討，其確切機(jī)制尚需以后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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(收稿日期:2009-03-25)