變應性鼻炎大鼠血清內源性Ｈ２Ｓ及ＮＯ表達水平變化研究

[摘要] 目的 觀察變態反應性鼻炎SD大鼠血清內源性硫化氫(H2S)、一氧化氮(NO)表達水平變化，并探討其意義。方法 20SD大鼠只隨機分為空白對照組、模型組，用甲苯-2，4-二異氰酸酯建立變應性鼻炎大鼠模型，用敏感硫電極法檢測血清H2S水平，酶法檢測血清一氧化氮水平，進行對比分析。結果 對照組血清內源性H2S:3.01μmol/L，NO:38.4μmol/L，模型組血清內源性H2S:4.25μmol/L，NO:46.2μmol/L，對照組低于模型組，具有統計學意義(P<0.05)。結論 變態反應性鼻炎大鼠血清內源性H2S、NO表達水平增高，可能對鼻粘膜的變態反應性炎癥起到調節作用，起到保護鼻粘膜的作用。

[關鍵詞] 硫化氫;一氧化氮;變應性鼻炎

[中圖分類號] R765.22[中圖分類號] A[文章編號] 1673-9701(2009)24-47-02

H2S和NO是機體內正常表達的氣體信號分子，具有廣泛的生理作用，并對機體免疫功能，炎癥反應等具有調節作用，有研究表明[1]，在變態反應性鼻炎時NO及INOS表達會發生改變，參與變態反應性鼻炎的發病及調節，本文就變態反應性鼻炎大鼠血清H2S和NO表達水平變化進行研究，并探討其機制及意義。

1資料與方法

1.1主要儀器及試劑

甲苯-2，4-二異氰酸酯(Toluene 2， 4-diisocyanate， 2， 4- TDI)(美國Sigma公司)，橄欖油(中國醫藥集團上海試劑公司)，水合氯醛(北京化學試劑公司)，721型分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司)，敏感硫電極(PAG/SI上海雷磁)，離心機3K30型(德國Sigma公司)，硫氫化鈉(南京建成生物工程研究所)，抗壞血酸南京建成生物工程研究所)，乙二胺四乙酸(南京建成生物工程研究所)。

1.2實驗動物分組與模型建立

30只健康SD大鼠，(購自鄭州大學醫學院實驗動物中心)6～8周齡，體重(200±25)g，雄性，隨機數字表發分為兩組，對照組、造模組，用橄欖油將2，4-TDI配成濃度為10%溶液作為致敏劑滴鼻，每側5μL，每日1次，共致敏7次。此后每2日1次，共致敏4次，致敏時間共15d。從第1次給藥開始記錄鼻部癥狀如鼻癢(致敏動物用前爪抓鼻)、噴嚏、清涕，評分，疊加分數，記總分。總分超過5分者模型成功，②激發:致敏結束、模型成功后每2天用10% 2，4-TDI溶液滴鼻，激發1次，維持癥狀。鼻部癥狀評分標準[2]:①鼻癢:輕度，輕擦鼻幾次，1分;重度，抓撓鼻、面不止，到處擦磨，2分;②噴嚏:1～3個1分，4～10個2分，11個以上3分;③流清涕:流至前鼻孔1分，超過前鼻孔2分，流涕滿面3分。對照組給藥方法，藥品為單純橄欖油。

1.3標本采集

最后一次激發24h后腹腔注射10%水合氯醛(0.6g/kg)麻醉小鼠，麻醉后經中線無菌開胸，剪開心包膜，打開心臟，取血2mL，于4℃2000r/min低溫離心10min，取血清保存于-70℃深低溫冰箱待測。

1.4血清內源性H2S檢測

采用敏感硫電極法:配制標準硫離子溶液濃度分為1mol/L，分別稀釋至1、10、20、30、40、50、60、80μmol/L，測定S離子濃度后繪制標準曲線，血清中加入抗氧化液使H2S、NaTris生成S2-，每次測定前將敏感硫電極及試管用去離子水沖洗3次，將敏感硫電極與參比電極一起浸入到樣品中，測定血清H2S濃度，待讀數穩定后紀錄，再根據標準曲線計算出H2S的濃度。

1.5血清NO檢測

采用硝酸銀還原酶法:在標準管及樣品管依次加入操作步驟:空白管加0.1mL雙蒸水，標準管加0.1mL標準液，樣品管加0.1mL血清，各管加0.1mL緩沖液，0.1mL硝酸還原酶，37℃孵育30min。加顯色劑A 0.5mL，顯色劑B 30.5mL，室溫靜置10min， 550mn比色，空白管調零，測定各管A值，按說明書給定公式計算NO濃度(測定過程嚴格按照說明書操作)。

1.6統計學處理

數據的統計及分析使用SPSS11.5軟件，實驗結果以均數±標準差(χ±s)表示，統計學方法采用方差分析。

2結果

模型組H2S及NO濃度同向升高，同對照組相比，具有顯著差異(P<0.05)。見表1。

3討論

H2S及NO是近年來相繼發現的氣體信號分子，對機體的生理功能具有廣泛的調節作用，在肝臟疾病，心血管疾病，神經系統疾病中扮演著重要角色，近年來發現，H2S及NO對疾病狀態下機體的免疫功能及炎癥反應起著調節作用，NO能直接介導趨化中性粒細胞及對內皮誘發的血管收縮發揮反饋調節作用，而抑制內皮素的生物合成，抑制肥大細胞增殖，脫顆粒，調節肥大細胞釋放多種介質[3]。NO活化無活性的GTP環化酶，致cAMP/ cGMP比值下降，能觸發過敏細胞釋放遞質，導致過敏癥狀的發生[4]。NO可抑制嗜酸性粒細胞(eosinophile granulocyte，EOS)的程序性死亡，引起EOS及其釋放的炎癥介質的聚集，從而加重及延長了變態反應的程度及時間[5]。變應性鼻炎時Thl激活產生大量NO，抑制其自身細胞因子的產生及增殖，形成負反饋環，從而限制自身激活增殖，對Thl/Th2的平衡具有調節作用[6]。H2S在炎癥反應中具有明顯的抑制多形核中性白細胞聚集、減輕內毒素引起的肺水腫和肺毛細血管通透性增高等炎癥反應的作用，而且能有效減少丙二醛的產生，可能為一種炎癥抑制因子[7]。在本組試驗中，模型組H2S與NO較對照組明顯升高，與周衛東在試驗中觀察到的NO變化一致，推測可能與變態反應性鼻炎后及鼻粘膜誘導型一氧化氮合酶表達增強有關[1]，其次變應性鼻炎時TH1細胞的增量上調，可能促進了NO的合成，H2S主要由胱硫醚-β-合成酶(cystanthionine-β- synthetase，CBS)與胱硫醚-γ-裂解酶(cystanthionine-γ-splitting enzyme，CES)合成，目前尚未見關于CBS、CES在鼻粘膜表達的報道，其增高可能與變應性鼻炎時局部的微循環改變及炎性介質的釋放引起H2S表達上調有關，在變應性鼻炎時NO表達增高能促進炎癥介質的釋放，介導過敏反應，H2S的表達上調，可能與NO表達上調有關[8]，抑制局部的炎癥及過敏反應，維持氣體信號的表達及作用平衡，其具體機制及其對鼻粘膜產生的作用有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] 周衛東，李繼紅，楊代茂，等. 慢性鼻炎鼻粘膜中一氧化氮合酶的表達[J]. 山東大學基礎醫學院學報，2003，17(6):333-335.

[2] 中華醫學會耳鼻咽喉科分會，中華耳鼻咽喉科雜志編委會. 變應性鼻炎診斷標準及療效評定標準[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志，1998，33(3):134-135.

[3] 姜帆，姜船. 一氧化氮(NO)在臨床醫學中的意義[J]. 現代檢驗醫學雜志，2007，22(6): 63-65.

[4] Fecho K M，Aslonek K A，DykstraL A，et al. Mechanism where by maerophage-derived nitric oxideisinvolved inmorphine-induced suppression of splenic lymphocyte proliferayion[J]. J Pharme EXP Ther，1995，272:477-483.

[5] Beauvms F，Michel L，Dubertret L， et al. The nitric oxide donors，azide and hydroxylamine，inhibit the programmed cell death of eytokine-deprived human eosinophils[J]. FEBS Lett， 1995， 361:229- 232.

[6] 王憲，陳明哲. 一氧化氮和細胞因子之間的相互調節作用[J]. 生理科學進展，2000，31(1):61-64.

[7] 盂祥艷，魯平，凌亦凌，等. 氣體信號分子硫化氫在脂多糖誘導大鼠肺急性炎癥反應中的作用[J]. 河北醫科大學學報，2005，26(2):231- 331.

[8] 王燕飛，杜軍保. 硫化氫與一氧化氮的相互作用[J]. 實用兒科臨床雜志，2005，20(9):928-930.

(收稿日期:2009-03-02)