PUMA在大鼠胰腺移植缺血

曲恒怡

[摘要] 目的探討PUMA在移植胰腺缺血再灌注損傷中的早期促凋亡作用。方法對封閉群大鼠建立大鼠腔靜脈內分泌引流、腸道外分泌引流的動物模型.再灌注后第0 、1 、2 、3 、4 、6 、9 、12 h 等時點, 每時點處死5只大鼠,切取移植胰腺,石蠟包埋切片,原位DNA缺口末端標記( TUNEL) 法測定胰腺組織細胞凋亡, Western blot方法測定移植胰腺組織PUMA,bcl-2 、bax、 caspase-3蛋白表達. 結果再灌注術后第0 、1 、2 、3 、4 、6 、9 、12 h,胰腺細胞凋亡數分別為(29.42 ±4.93) 、(47.65 ±6.43) 、(74.8 ±9.73) 、(106.35 ±16.8) 、( 148.71 ±19.50) 、(123.96 ±15.54) 、( 97.32 ±10.6) 和(57.42 ±9.56)個/ 高倍視野。各時點均顯著高于正常胰腺23.48 ±4.26。第4小時細胞凋亡數明顯增高,12小時降低到最低值,不同組細胞凋亡數的差異有統計學意義( v=42 t=2.785P<0.01); PUMA以及其下游的 bax和caspase-8蛋白表達在第4小時達到最高峰, 12小時降低到最低值, bcl-2在第4小時達到最低值,蛋白表達差異分別有統計學意義(P<0.05), 以后逐漸升高,12小時降低到最低值, PUMA表達與各時點的細胞凋亡數有明顯的正相關 ( n=5,r=1.00,p<0.05)結論I/RI后細胞早期凋亡與PUMA活化有關, PUMA是通過調節下游bax、caspase-8、bcl-2基因發揮凋亡促進作用。

[關鍵詞] 胰腺移植; 缺血再灌注損傷;凋亡;PUMA蛋白;

[中圖分類號] R364.3 [文獻標識碼] A[文章編號] 1004-8650(2009)12-032-02

近年來大量研究表明,細胞凋亡是器官移植缺血-再灌注損傷( ischemia-reperfusioninjury,I/RI)的早期事件[1],但細胞發生凋亡的機理不明。PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)是2001年發現的p53下游促凋亡基因,是bcl-2家族BH-3亞家族中的成員,PUMA在受到p53、缺氧、放射、化療、等刺激信號下迅速被激活,從而導致PUMA下游bcl-2家族基因的活性改變,引起細胞色素C的釋放和Caspase酶的活化,最終導致細胞凋亡[2-3]。本研究應用大鼠胰十二指腸移植模型, 探討PUMA在大鼠胰十二指腸移植I/RI中的早期凋亡促進作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物:43只(對照組3只)清潔級封閉群SD大鼠(供體), 體質量250～ 300g ,雄性;清潔級封閉群W istar大鼠, 40只,體質量300-350g, 雄性, 均由上海實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑:鼠抗人PUMA多克隆抗體購自Cell Signals公司,兔抗鼠bcl-2 、bax、 caspase-3、Actin多克隆抗體和Western bloting試劑購自Santa Cru公司,細胞凋亡檢測試劑盒購南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1 大鼠胰腺移植動物模型的制備:見文獻[4]。……