肝細胞生長因子基因修飾間充質干細胞治療股骨頭壞死的探索性研究

樓 曉 宮恩年 商豐元 魏成剛 施志超 汪勁松 吳祖澤 郭子寬

肝細胞生長因子基因修飾間充質干細胞治療股骨頭壞死的探索性研究

樓 曉 宮恩年 商豐元 魏成剛 施志超 汪勁松 吳祖澤 郭子寬

目的探討肝細胞生長因子基因修飾自體骨髓間充質干細胞治療股骨頭壞死的可行性，并評價其療效。方法對1例ARCOⅢB股骨頭壞死患者，手術過程中局部注射肝細胞生長因子基因修飾的自體骨髓間充質干細胞1×107個，隨訪觀察評價其臨床療效和影像學改變。結果治療過程順利，術后無感染及過敏等嚴重并發癥發生。術后隨訪9個月，患者髖關節疼痛指數較治療前明顯降低，髖關節臨床癥狀Harris評分分值由治療前的63分提高到治療后的76分，髖關節活動度Harris評分由治療前分值2.5分提高至4.2分。CT掃描顯示損傷局部出現重建性骨修復，低密度區范圍縮小，密度增高。ARCO分期由ⅢB改善至ⅢA。結論肝細胞生長因子基因修飾的自體骨髓間充質干細胞治療股骨頭壞死，安全有效，本次探索為進一步臨床研究奠定了基礎。

股骨頭壞死間充質干細胞肝細胞生長因子

股骨頭壞死（Osteonecrosis of the femoral head， ONFH）是臨床常見病，多發于青壯年，嚴重影響勞動能力和生活自理能力。多數患者不得不行人工關節置換，而中青年患者的關節置換手術后，仍需再次更換，且長期療效難以預測[1]。因此，現在多主張早期保守治療，阻止病情進展，以避免或延緩人工關節置換[2]。

股骨頭壞死基本病理變化包括兩個方面：①由于外傷、藥物和其他因素引起的微循環障礙，導致股骨頭血液供應不足；②血供障礙引起骨組織損傷壞死，繼發骨性關節炎，關節功能喪失。因此，ONFH恰當的治療措施必須將促成骨和促血管新生有機地結合起來[3]。本研究將利用重組肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）腺病毒感染自體骨髓間充質干細胞（Mesenchymal stem cells,MSCs），將HGF的促血管新生功能和MSCs的成骨功能結合起來，通過細胞治療的手段，進行骨損傷修復，為治療ONFH提出一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料

患者，女，48歲，術前髖關節酸痛，活動受限，跛行，病程5年。CT掃描示股骨頭骨質疏松，骨硬化及囊性變，關節囊腫脹、積液。曾有激素藥物治療史。根據世界骨循環研究學會（ARCO）的國際骨壞死分期標準[4]，診斷為右側股骨頭壞死ⅢB。患者同意接受肝細胞生長因子基因修飾的自體骨髓間充質干細胞治療，并簽署知情同意書。

1.2 自體骨髓MSCs的分離培養和MSCs－HGF的制備

利多卡因局麻下自髂后上棘處行骨髓穿刺，以預含2 mL肝素鈉（100 U/mL）的10 mL注射器抽取骨髓10 mL，于GMP級細胞實驗室中的超凈工作臺內稀釋骨髓液，加于淋巴細胞分離液，行密度梯度離心，獲得骨髓單個核細胞，以2×105cells/cm2的密度接種于含2.5%血小板裂解物（Platelet lysates，PL）的α－MEM培養基的塑料平底培養瓶中。37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中靜置培養48 h后，去除非貼壁細胞。細胞生長至80%融合時，以0.05%的胰蛋白酶進行消化、傳代和擴增。達到所需細胞數目時，在無血清培養體系中按MOI=150∶1加入Ad－HGF腺病毒載體，48 h后收獲細胞，稱為MSCs－HGF，計數1.0×107個后立即用于植入治療。

1.3 植入方法

在持續硬脊膜外麻醉下，患者接受明膠海綿填塞術，術中局部注射MSCs－HGF細胞懸液2 mL，常規縫合。

1.4 術后處理

術后去枕平臥6 h，監測體溫、脈搏、呼吸及血壓等變化，注意觀察切口，必要時更換敷料。術后3個月內不能負重，3個月后扶拐負重，期間進行常規的肌肉功能鍛煉，定期復查髖部X線片、MRI和CT掃描。

1.5 隨訪與評價

術后隨訪患者，根據WOMAC評價標準[5]，對髖關節疼痛進行評價，疼痛程度則以目視類比式測量器（VAS）進行測量（0～100分）。

隨訪時復查髖部X線片和CT掃描，并與術前資料對比，給予髖關節功能Harris評分（HHS），進行療效評價[6－7]，HHS＞90分為優，75～90分為良，60～74.9分為可，＜60分評定為差。同時計算髖關節活動度HHS分值，評價項目包括關節屈、伸、展、收、旋轉度，并根據影像學改變再次進行ARCO分期。

2 結果

患者手術順利，術后無感染、過敏、血管神經損傷等并發癥發生，切口愈合好，髖部疼痛減輕。用CPM關節被動練習一周后，扶拐下床活動。

對患者進行了術后3個月和9個月的兩次隨訪，復查髖部X線片和CT掃描，術前股骨頭局部塌陷，關節面部分消失，股骨頭內見囊性變及硬化邊。術后CT掃描顯示出現重建性骨修復，低密度區范圍縮小，密度增高，骨小梁和新骨生成，股骨頭局部塌陷重新隆起，消失的關節面大部分恢復（圖1）。術后9個月，ARCO國際骨壞死分期為ⅢA。

圖1 治療前后的患髖X線片和CT掃描評價

髖關節疼痛指數變化：患者術前疼痛指數是56，術后3個月和9個月時疼痛指數分別是48、42，疼痛指數明顯降低（圖2）。

圖2 治療前后的疼痛指數評價

患側髖關節進行Harris評分：髖關節臨床癥狀HHS分值由治療前的63分顯著提高到治療后的76分，髖關節活動度HHS分值由治療前的2.5分提高至治療后的4.2分（圖3）。

圖3 治療前后的Harris評分

3 討論

股骨頭壞死是由于多種病因破壞股骨頭的血供，使骨的活性成分（包括骨細胞、骨髓細胞和脂肪細胞）死亡所引起的一個病理過程，隨后機體對壞死區進行自然修復，壞死骨小梁被逐步吸收，股骨頭力學強度下降，塌陷變形，從而導致骨性關節炎和髖關節功能的嚴重損傷[8]。其病因大致分為創傷性和非創傷性兩大類。目前對于股骨頭壞死的治療主要有非手術保守治療、姑息性手術治療和人工關節置換。人工關節置換術主要用于晚期繼發髖關節骨性關節炎的患者且受病變程度、年齡和人工關節使用壽命等因素的制約，因而并非是首選方法[9]。ONFN的理想治療應在早期阻止骨質繼續壞死，促進骨再生，改善股骨頭內血液循環，防止塌陷，改善臨床癥狀，延緩進行人工髖關節置換的時間。然而，早期治療方法雖多，但尚無一種方法能取得滿意的效果[10]。近年來，隨著生物治療理論和骨組織工程學的不斷發展，一些新型臨床技術逐漸得到應用并取得較好的效果。

近期研究已發現，股骨頭壞死與局部MSCs增殖能力下降或活力不足相關[11]。干細胞研究是生命科學的熱點，也越來越顯示出對臨床醫學進步的革命性推動作用。間充質干細胞是目前應用廣泛的一類成體干細胞，可向成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞分化，是骨組織工程研究的最佳種子細胞[12-14]。由于其分離培養簡便，低免疫原性，分泌多種成骨活性因子，能在骨損傷壞死局部促進爬行替代和新骨形成，間充質干細胞已被美國FDA批準應用于多項骨損傷修復的臨床試驗中[15]。

髓芯減壓可以暫時降低骨內壓，延緩早期骨壞死的自然過程，但并沒有徹底解決股骨頭的修復問題。骨內壓升高的惡性循環會不斷降低股骨頭生物強度，最終導致股骨頭塌陷[16]。在本病例中，治療后9個月，CT掃描顯示出現重建性骨修復、低密度區范圍縮小、密度增高、骨小梁和新骨生成、股骨頭局部塌陷重新隆起、消失的關節面大部分恢復，HHS分值提高，ARCO分期由ⅢB改善至ⅢA，這證實了MSCs-HGF的體內骨修復能力。

目前有關干細胞治療股骨頭壞死的報道絕大多數為直接局部注射骨髓單個核細胞，罕見運用分離培養的間充質干細胞進行治療[3]。事實上，骨髓中間充質干細胞含量很低，約為105～106分之一，因此必須經過體外擴增才能達到治療劑量，發揮相應生物效應。我們的動物研究已表明，MSCs可以促進骨缺損部位的骨形成[17]。

壞死部位普遍存在缺血、缺氧、缺乏營養的不利環境，不利的局部環境勢必影響植入細胞的生存、再生、分化和修復，難以取得預期效果。因此，針對股骨頭壞死的生物治療，除糾正成骨缺陷，還應包含促進血管新生、改善局部血供的策略。肝細胞生長因子是一種可引起多種細胞生物學效應的細胞因子，與其受體c-MET結合后，能激活MAPK、PI3K、鞘氨醇激酶等多種細胞內信號途徑，發揮促細胞增殖、促細胞遷移、抑制細胞凋亡、促血管新生、抗纖維化和修復組織損傷等生物學作用[18]。我們之前的研究證實，MSCs-HGF擁有比MSCs更好的抗低氧損傷能力[17]。本研究利用我室研制的Ad-HGF腺病毒載體，轉導MSCs，從而將HGF的促血管新生、促細胞增殖作用與MSCs的條件成骨能力有機結合，發揮有效的骨修復效應。這是國內首次MSCs-HGF治療股骨頭壞死的臨床應用，并取得令人欣喜的療效，必將進一步推動股骨頭壞死生物治療的研究與實踐。誠然，相關的臨床治療方案仍需進一步探討和規范，以期擴大病例數，使之成為一種常規的臨床新技術。

[1]Babis GC,Soucacos PN.Effectiveness of total hip arthroplasty in the management of hip osteonecrosis[J].Orthop Clin North Am, 2004,35(3):359-364.

[2]李子榮,張念非,史振才,等.股骨頭壞死塌陷的預測與治療方法的選擇[J].中華骨科雜志,2003,23(4):193-196.

[3]王恒湘,郭子寬.間充質干細胞在組織再生應用中的諸多問題[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4(5):241-245.

[4]李子榮.股骨頭壞死的ARCO分期[J].中華外科雜志,1996,34(3): 186-187.

[5]Beliamy N,Buchanan WW,Goldsmith CH,et al.Validation study of WOMAC:a health status instrument for measuring clinically important patient relevant outcome to antirheumatic drug therapy in patient s with osteoarthritis of the hip or knee[J].J Rheumatol, 1988,15:1833-1840.

[6]Harris WH.Traumatic arthritis of the hip after dislocation and acetabular fractures:treatment by mold arthroplasty.An end-result study using a new method of result evaluation[J].J Bone Joint Surg Am,1969,51(4):737-755.

[7]王巖,朱盛修,袁潔,等.成人股骨頭缺血壞死療效評價(百分比)草案[J].骨與關節損傷雜志,1994,9(2):142-144.

[8]Jones LC,Hungerford DS.The pathogenesis of osteonecrosis[J]. Instr Course Lect,2007,56:179-196.

[9]Mont MA,Jones LC,Seyler TM,et al.New treatment approaches for osteonecrosis of the femoral head:an overview[J].Instr Course Lect,2007,56:197-212.

[10]Hing C,Back D,Shimmin A.Hip resurfacing:indications,results, and conclusions[J].Instr Course Lect,2007,56:171-178.

[11]Lee JS,Lee JS,Roh HL,et al.Alterations in the differentiation ability of mesenchymal stem cells in patients with nontraumatic osteonecrosis of the femoral head:comparative analysis according to the risk factor[J].J Orthop Res,2006,24(4):604-609.

[12]Noel D,Djouad F,Jorgense C,et al.Regenerative medicine through mesenchymal stem cells for bone and cartilage repair[J].Curr Opin Inves tig Drugs,2002,3(7):1000-1004.

[13]Jiang Y,Jaliagirdar BN,Reinhard RL,et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow[J].Nature, 2002,418(6893):41-49.

[14]Owen M.Marrow stromal stem cells[J].J Cell Sci,1988,10:63-76.

[15]Tzaribachev N,Vaegler M,Schaefer J,et al.Mesenchymal stromal cells:a novel treatment option for steroid-induced avascular osteonecrosis[J].Isr Med Assoc J,2008,10(3):232-234.

[16]Mont MA,Tomek M,Hungerford DS.Core decompression for avascular necrosis of the distal femur long term follow-up[J]. Clin Orhtop,1997,334(1):124-130.

[17]宮恩年,樓曉,商豐元,等.肝細胞生長因子基因修飾的間充質干細胞治療兔股骨頭壞死[J].組織工程與重建外科雜志,2008, 4(3):121-124.

[18]Gong R.Multi-target anti-inflammatory action of hepatocyte growth factor[J].Curr Opin Investig Drugs,2008,9(11):1163-1170.

Exploratory Research for Hepatocyte Growth Factor Gene-Modified Mesenchymal Stem Cells on Femoral Head Osteonecrosis

LOU Xiao1,GONG Ennian2,SHANG Fengyuan2,WEI Chenggang2,SHI Zhichao2,WANG Jinsong1,WU Zuze1,GUO Zikuan1.
1 Institute of Radiation and Irradiation Medicine,Academy of Military Medical Science,Beijing 100850,China;2 66400 Orthopaedic Hospital of PLA,Beijing 100143,China.Corresponding author:GUO Zikuan.

ObjectiveTo explore the clinical feasibility and therapeutic effect of mesenchymal stem cells modified by hepatocyte growth factor gene for treating femoral head osteonecrosis.MethodsAutologous bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)from one patient with osteonecrosis of the femoral head in a stage of ARCOⅢB were separated and expanded in vivo.Cells were modified by an adenoviral vector carrying human hepatocyte growth factor gene,and total cells of 1.0×107were surgically implanted into the necrotic sites of the affected femoral head.During the nine-month follow-up,the clinical symptoms and imaging change were evaluated.ResultsNo any severe complications that without obvious infection and allergy were observed.After nine months,there was a significant reduction in hip joint pain measured with the WOMAC index.The Harris scores of hip joint were obviously improved,which indicated respectively for clinical symptoms(63 versus 76)and for joint range of motion(2.5 versus 4.2).Computer Tomography displayed reconstructive repair manifestation,which exhibited as decreased low-intensity region accompanied with new bone formation.The classification of disease severity was improved from stage-ⅢB to stage-ⅢA,according to the system of the Association Research Circulation Osseous.Conclusion Implantation of autologous MSCs modified by hepatocyte growth factor gene was one of safe and effective treatment for osteonecrosis of the femoral head.Our results here might provide supportive data for further large scale clinical trials.

Femoral head necrosis;Mesenchymal stem cells;Hepatocyte growth factor

R683.42

A

1673－0364（2009）－02－0083－04

2008年12月22日；

2009年1月25日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.006

國家高技術研究發展計劃（863項目）（2007AA02Z454）。

100850北京市軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所（樓曉，汪勁松，吳祖澤，郭子寬）；100143北京市北京66400部隊骨病醫院（宮恩年，商豐元，魏成剛，施志超）。

郭子寬。