血小板裂解物支持人骨髓基質細胞的擴增

樓 曉 汪勁松 靳繼德 何梓銘 吳祖澤 郭子寬

·論著·

血小板裂解物支持人骨髓基質細胞的擴增

樓 曉 汪勁松 靳繼德 何梓銘 吳祖澤 郭子寬

目的探討血小板裂解物體外培養、擴增人骨髓基質干細胞的可行性。方法將富含血小板血漿以凍融裂解法處理，培養人骨髓基質干細胞；體系中加入不同濃度的裂解物，MTT法檢測細胞體外增殖情況；流式細胞儀分析細胞表型特征，并應用細胞化學染色法觀察細胞體外成骨和成脂肪能力。結果血小板裂解物培養的骨髓基質干細胞呈典型的成纖維細胞形態，均一呈現CD14、CD31、CD34、CD45及HLA-DR陰性和CD73、CD90、CD105、CD166陽性，具備體外成骨、成脂分化能力。此外，與經篩選的胎牛血清比較，低濃度血小板裂解物即具有支持骨髓基質干細胞擴增的能力。結論血小板裂解物可替代胎牛血清，用于骨髓基質干細胞的體外擴增。

骨髓基質細胞血小板細胞培養擴增

骨髓基質細胞（Mesenchymal stromal cells, MSCs）是一種主要存在于骨髓的未分化多能細胞，具有分化為多種結締組織細胞的潛能，包括成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、基質細胞、成纖維細胞和肌腱細胞等[1]。越來越多的證據表明，MSCs是再生醫學和組織工程研究中的重要種子細胞。由于直接從體內獲取的MSCs數量很低，無法滿足臨床治療要求，所以必須進行體外培養擴增。目前，國內外臨床級別MSCs的擴增體系，多含有經過篩選的牛血清為主要營養支持物[2]。將這種體系應用于臨床試驗，增加了人畜共患病和異種免疫反應的風險[1]。因此，我們將處理后的富血小板血漿用于MSCs的培養擴增，探討能否使其替代胎牛血清成為新的MSCs培養支持物。

1 材料與方法

1.1 血小板裂解物的制備

富血小板血漿由全軍采供血中心制備。收集5人份的ACD-A抗凝CS 3 000 Plus機采血小板，每份20 mL。混勻后直接于-80℃和37℃反復凍融3次，稱為血小板裂解物（Platelet lysates,PL）。900 g離心30 min取上清，分裝凍存于-80℃冰箱備用。

1.2 人MSCs的分離培養

從5名體檢合格的正常骨髓捐獻者采髓獲取10 mL肝素抗凝無菌骨髓血混合液。將骨髓有核細胞稀釋為1.0×107cells/mL，淋巴細胞分離液密度離心。吸取中間白膜層，計數后按2.0×105cells/cm2的密度接種于細胞培養皿內，置于37℃、5%CO2、飽和濕度溫箱中貼壁培養。培養體系為含10%胎牛血清（Stemcell公司）的α-MEM培養液。每周2次換液，細胞融合接近90%時，以0.05%胰蛋白酶消化傳代。第3代細胞按實驗分組采用不同的培養體系。

1.3 細胞增殖能力測定

將第3代細胞以1.5×103個/孔接種于平底96孔板內，每孔200 μL的不同培養體系（10%FBS、5% PL），復孔為3，均設平行對照孔和空白調零孔，將培養板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養72 h。然后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。

1.4 MSCs細胞表型的流式分析

光鏡下觀察細胞形態，流式細胞儀對培養細胞進行表型鑒定。取1.25%PL培養的第5代接近融合的MSCs，用0.05%胰蛋白酶消化，計數后取2×106個細胞，分裝8管，每管加入10 μL熒光素標記的小鼠抗人抗CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD166及HLA-DR單克隆抗體，另設2管為空白對照。室溫避光反應30 min后，PBS洗滌2次，加入500 μL PBS混勻細胞。流式細胞儀（FACScalibur）收集數據，Winmdi 29軟件分析細胞熒光強度。

1.5 成骨分化的定向誘導與鑒定

將1.25%PL培養的第5代MSCs，按1×104個/孔接種于24孔培養板，每孔加入0.5 mL完全培養基（含2.5%PL），貼壁24 h之后替換成0.5 mL新的成骨誘導體系（地塞米松0.1 μmol/L、β-甘油磷酸鈉鹽10 mmol/L、抗壞血酸磷酸鹽50 μmol/L），每3天全量換液。培養第2周，按堿性磷酸酶檢測試劑盒操作步驟進行堿性磷酸酶染色。

1.6 成脂分化的定向誘導與鑒定

將1.25%PL培養的第5代MSCs，按1×104個/孔接種于24孔培養板，每孔加入0.5 mL完全培養基（含2.5%PL），貼壁24 h之后替換成0.5 mL新的成脂誘導體系（地塞米松1 μmol/L、I BMX 0.5 mmol/L、吲哚美辛100 μmol/L），每3天全量換液。培養第2周，進行油紅O染色，鏡下觀察細胞內脂肪小滴形成情況。

1.7 統計學分析

數據以均數±標準差（X±SD），采用SPSS 13.0統計軟件進行t檢驗，P＜0.05為具有統計差異。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

經淋巴細胞分離液分離獲得的骨髓單個核細胞，接種72 h后鏡下觀察，可見散在分布的貼壁紡錘形細胞，經兩次全量換液后可基本去除非貼壁細胞。培養7～10 d，細胞克隆增大，接近80%融合。傳代后的MSCs形態均一，呈成纖維細胞樣，排列緊密，生長旺盛，融合密度可達2.0×104cells/cm2（圖1）。

圖1 經含PL培養基培養的MSCs細胞形態觀察（100×）

2.2 細胞擴增效率評價

將1.5×103個/孔接種的MSCs分別以不同體系培養（10%FBS、5%PL），MTT法比較72 h時的細胞增殖狀況（圖2）。發現5%PL對MSCs的促增殖作用明顯優于10%FBS（P＜0.01）。

2.3 細胞表型分析

流式細胞儀分析經1.25%PL培養的MSCs表型，表達CD29、CD73、CD166，陽性率均在95%以上；不表達CD31、CD34、CD45及HLA-DR。說明所獲得細胞在細胞表型上符合MSCs特性，其純度可達到95%以上（圖3）。

圖2 MTT法比較10%FBS與5%PL培養的MSCs增殖能力

圖3 PL培養的人骨髓MSCs表型特點

2.4 細胞的定向誘導分化

2.4.1 成骨分化

圖4 MSCs向成骨細胞的分化（200×）

細胞在成骨誘導體系中培養2周之后，多聚甲醛固定，NBT/BCIP染色，發現誘導組細胞漿內顯示為藍色顆粒狀物（圖4A）。對照組細胞未加誘導劑，堿性磷酸酶染色呈陰性（圖4B）。

2.4.2 成脂分化

定向誘導培養后1周，小部分細胞內已出現微小明亮的脂滴。隨著誘導時間的延長，出現脂滴的細胞增多，細胞由梭形變成橢圓形或多角形。培養2周后，脂滴數目增多、融合。油紅O染色后鏡下觀察，細胞內脂滴呈明亮的橙紅色（圖5）。

圖5 PL培養的MSCs具備體外成脂肪能力

3 討論

MSCs是一群多能的成體干細胞，主要由骨髓中分離獲得，也可從骨實質、脂肪組織、臍帶、臍血、胎肺、羊水、骨骼肌等組織中分離[1]。除了造血支持外，MSCs還具有免疫調節作用，是良好的細胞和基因治療載體，在自體和異體造血細胞移植過程中有著顯著的臨床價值[3-5]。MSCs分泌廣譜的生物活性分子，促進局部血管新生，抑制纖維化和瘢痕形成，改善局部微環境，是重要的組織工程種子細胞[6]。美國FDA已經批準多項涉及MSCs的臨床試驗[1]，包括:①MSCs輸注治療異基因骨髓移植中的移植物抗宿主反應；②MSCs靜脈輸注治療Crohn病；③MSCs局部應用治療牙周疾病；④MSCs靜脈輸注治療心肌梗死；⑤MSCs修復半月板損傷。由于對細胞數量的要求，所有的臨床試驗均面臨MSCs的體外擴增問題。然而，迄今為止，國際上并未建立一套公認的規范擴增方案和臨床流程。由于異種蛋白內在化、動物病毒感染和異種免疫反應等多種風險，早先建立的以胎牛血清為標準支持物的培養方案越來越受到人們的質疑。因此，避免使用異種血清的新型培養體系研究迫在眉睫。

關于MSCs的定義，學術界形成了包括物理學、形態學、表型和功能屬性的四項基本共識[1]。2006年，國際細胞治療學會間質組織干細胞委員會提出了3條最低標準：塑料貼附性、特定的細胞表面抗原表達和多向分化潛能[7]。本研究中我們使用PL作為非異種血清的新型培養體系，所獲得的細胞為典型的成纖維細胞樣形態，呈漩渦狀、塑料貼壁生長，經流式細胞儀檢測高表達間質細胞標記CD73、CD166和CD29，不表達造血細胞標記CD34、CD45和內皮細胞標記CD31。在一定的誘導條件下，MSCs可定向分化為成骨細胞和脂肪細胞，具有多向分化潛能。比照定義標準，我們研究的PL體系與標準FCS體系一樣可獲得具有典型生物學特性的MSCs，質量可靠。

應用于臨床治療，MSCs需要在較短時間內擴增至足量的細胞數目。因此，對于MSCs培養支持物，除了要獲得符合標準的細胞，還需要良好的擴增效率。在某種程度上，這是關鍵問題。我們將其作為基本問題考察了PL新培養體系的擴增效率。有人研究用自體血清來擴增MSCs，卻發現過了第1代后，即產生生長停滯[8]。在臨床應用中，體外擴增一般不超過第3代即回輸體內。我們選用第5代細胞可反應具體應用的各種實際情況，因此我們的結果具有現實價值。MTT增殖試驗表明，PL體系對MSCs的擴增效率優于傳統FCS體系。相對于FCS體系，PL體系發揮促MSCs增殖的作用，可能主要依賴于其間存在的細胞因子，例如PDGF、TGF-β、IGF、EGF、FGF、VEGF等[9]。為了排除不同個體來源間的差異，我們將5人份PRP混勻制備PL以減少差異。目前我國臨床用血普遍緊張，因此我們需要尋求一個較低的最適濃度。我們的結果已表明，1.25%的PL濃度即可獲得與10%FCS相當的擴增效率，這大大降低了使用量，也為日后開展有關研究提供了理論依據。

PL擴增效應的內在分子機制，及其對MSCs的分子學改變都有待更多的研究來揭示。此外，血小板相關膜抗原引發的體內免疫學反應也應引起重視。

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Platelet Lysates Enhance the Proliferation of Human Bone-Marrow Stromal Cells In Vitro

LOU Xiao,WANG Jinsong,JIN Jide,HE Ziming,WU Zuze,GUO Zikuan.
Institute of Radiation and Irradiation Medicine,Academy of Military Medical Science,Beijing 100850,China.Corresponding author:GUO Zikuan.

ObjectiveTo investigate the suitability and proliferation capacity of human platelet lysate in the production of bone-marrow stromal cells.MethodsHuman platelet lysates(PL)were prepared by freezing and thawing the platelet rich plasma.Marrow stromal cells(MSCs)were cultured in media containing PL and their proliferation status was evaluated by MTT assay.Furthermore,cell phenotypic characteristics were analyzed by flow cytometry and the differentiation along adipogenic and osteogenic pathways were assessed by histological staining in vitro.ResultsMSCs cultured in medium containing platelet lysates displayed a typical fibroblast-like morphology.Flow cytometry showed that they were homogenously negative for CD14,CD31,CD34,CD45 and HLA-DR and positive for CD73,CD90,CD105 and CD166.Differentiation capacity was preserved throughout the long-term culture.Compared with fecal calf sera(FCS)selected from lots,platelet lysates exhibited more potent activities to support the expansion of MSCs.ConclusionIt is concluded that human platelet lysates might be an optional substitute to FCS for MSCs proliferation in vitro.

Bone marrow stromal cells;Platelet;Cell culture;Proliferation

Q813.1+1

A

1673－0364（2009）－02－0061－04

2009年2月27日；

2009年3月30日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.001

國家高技術發展計劃項目（863）（2007AA02Z454），國家自然科學基金（30871018）。

100850北京市軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所實驗血液學研究室。

郭子寬。