植物種質資源離體保存技術研究進展

鐘蘭 劉玉平 彭靜

（武漢市蔬菜科學研究所，湖北武漢，430065）

植物種質資源離體保存技術研究進展

鐘蘭 劉玉平 彭靜

（武漢市蔬菜科學研究所，湖北武漢，430065）

植物種質資源的保存對于生物多樣性保護和新品種選育均具有十分重要的意義。綜述了國內外植物種質資源離體保存技術最新研究進展，并提出了有待繼續研究的相關問題。

植物種質資源 保存 組織培養 超低溫保存

種質資源又稱遺傳資源。種質系指農作物親代傳遞給子代的遺傳物質，它往往存在于特定品種之中。如古老的地方品種、新培育的推廣品種、重要的遺傳材料以及野生近緣植物，都屬于種質資源的范圍。種質資源是物種進化、遺傳學研究及植物育種的物質基礎，是保障人類良好生存環境和衣食住行必不可少的財富，是關系到一個國家和民族競爭力的重要戰略物質。但隨著人口的發展，土地的開發，自然環境的惡化，品種資源的流失日益嚴重，再加上現代農業的發展，品種單一化在世界范圍內愈演愈烈。因此，植物種質資源保存已成為全球關注的熱點課題。

20世紀60年代以來，世界各國（特別是經濟發達國家）對植物種質資源的收集和保存工作都加大了投入和研究力度，許多國家已建立了比較完善的田間基因庫。但是，田間活體保存占地廣，需要耗費大量的人力、物力和財力，易受自然災害影響。因此，許多科技工作者在尋求更經濟、實用、安全的保存方法。

20世紀50～60年代，植物組織培養技術開始出現，之后得到不斷完善和發展。1975年，Henshaw和Morel等首次提出離體保存植物種質資源的策略[1]。離體保存以其無菌培養、占用空間小、勞動力和維持開支少，易于國際間交流等特點克服了田間保存的缺點，從而得到了世界各國的重視[1]。有關國際組織和許多國家相繼建立了植物種質離體基因庫[3]。運用組織培養技術保存種質已取得了很好的效果，但是也產生了新的問題如頻繁繼代，容易導致體細胞無性系變異，從而使保存的原始種質丟失。經過許多科學家的努力，通過修正組織培養條件，主要是通過調整培養基配方、降低培養溫度來減緩保存材料的生長；超低溫技術的運用甚至能完全抑制保存材料的生長，從而延長繼代周期，控制變異的產生，使變異降低到可以接受的最低程度，并已取得重大進展。按照保存的技術手段，植物種質資源的離體保存方法可以分為一般保存、緩慢生長法保存和超低溫保存等。本文就種質資源離體保存技術方面的研究進展作一評述。

1 一般保存

一般保存是在常規培養條件下對培養物通過不斷繼代的方式進行保存的方法。目前，多數植物資源的離體保存仍采用這種方式。采用該方法保存的材料可以隨時進行擴繁，因此利用起來很方便，但由于需要不斷繼代培養，易造成材料的污染、混淆，甚至丟失，并且常會導致遺傳變異的發生。

2 緩慢生長法保存

緩慢生長法是通過調節培養條件，抑制保存材料的生長和減少營養消耗來延長繼代時間、減少操作和勞力的保存方法。減緩保存材料生長的具體途徑如下。

2.1 降低培養環境的氧氣含量

常用的方法是在材料上覆蓋一層礦物油和液體培養基。Caplin離體保存胡蘿卜根的次生韌皮部時，在保存材料上覆蓋一層重石油，最厚達38 mm，8個月后覆有礦物油的材料生長很少，而且仍是鮮艷的綠色，培養基未見減少，而未覆礦物油的材料變褐，培養基已漸干涸。但Engelmann[3]認為，這種方法易使外植體發生玻璃化現象，材料恢復正常培養條件后再生慢，易壞死。減少材料周圍的氧氣含量的另一條途徑是降低培養室的大氣壓或改變氣相成分。

2.2 營養控制

采用降低培養基中的營養也可以減少材料的生長，以達到延長保存時間的目的。菠蘿試管苗在無菌水和1/4 MS培養基中保存1 a，存活率分別達81%和100%，且比保存在完全MS培養基中的試管苗活力強。美國Hilo國家無性系資源圃已采用該技術進行菠蘿種質保存。趙密珍等發現，1/4 MS+ 0.5 mg/L BA+15 g/L蔗糖+12.5 g/L瓊脂是常溫保存草莓試管苗的最適培養基，在該培養基中草莓試管苗可保存11～13個月。鐵皮石斛試管苗在MS，1/2 MS和1/4 MS培養基上保存1 a后，MS培養基保存效果最差，存活率只有41.67%，而1/4 MS和1/2 MS培養基上的存活率分別為91.67%和100%。咖啡分生組織培養的小植株在無蔗糖的1/2 MS培養基上，可保存2.0～2.5 a。

2.3 培養基中添加生長調節劑

最常用的生長抑制劑有脫落酸（ABA）、丁酰井（B9）、多效唑（PP333）和矮壯素（CCC）等。在進行獼猴桃離體保存時，培養基中添加0.5 mg/L多效唑能夠有效抑制試管苗的生長，11個月后存活率為90%。張利平等對36個品種葡萄種質進行了常溫長期保存。發現多效唑適用于供試的36個品種，且多數基因型的葡萄試管苗已保存2 a，以2.0 mg/kg的濃度為好。研究表明，ABA對草莓試管苗芽增殖的抑制作用隨ABA使用濃度的增加而明顯增強，且均存在顯著性差異，從常溫保存試管苗的存活率看，以3.0 mg/LABA處理對草莓試管苗保存效果最為理想，保存到12個月時，試管苗的存活率最高，為62.5%，較不使用ABA處理的保存時間延長5個月以上。在紅根草試管苗的保存中,CCC濃度為1.2 mg/L和1.6 mg/L時，保存360 d時存活率仍達90%。王桂蘭等研究指出，200 mg/L B9處理的蘋果轉接苗均因抑制過度而死亡；100 mg/L B9抑制作用明顯，保存4個月后蘋果試管苗節間極小、葉小色深呈蓮座狀，說明B9的生長延緩作用較為劇烈，所以不適宜蘋果試管苗的保存。

2.4 降低培養溫度

采用控制溫度來降低或完全抑制保存材料生長是中期保存最常用的方法。不同植物種類要求的最佳保存溫度不盡相同，甚至相差很大。一般耐寒物種在0～5℃下進行保存，而一些亞熱帶物種一般要保存在10℃左右，一些熱帶物種則必須保存在15℃以上。Oka等在5℃下保存 “Senryo”梨（）和西洋梨品種“Winter Nelis”莖尖分生組織，64周后存活率及再生率幾乎為100%，而0℃下保存4周后即死亡。Reed在4℃下，用聚乙烯塑料袋保存96個較抗寒的草莓品種植株，12個月后，存活率達76%。蛇根木（）是一種瀕危的珍貴藥用植物，在25℃下離體保存節部組織，繼代周期為9個月，在15℃下為15個月，溫度如降為10℃和5℃，保存材料則壞死，2個月后都死亡。

2.5 提高培養基滲透壓

通常在培養基中加入甘露醇、蔗糖或者山梨醇等來提高培養基的滲透壓，從而抑制材料的生長。這類化合物是惰性物質，不易被外植體吸收，而且抑制外植體生長的作用持久。在MS培養基添加1%～3%甘露醇，淡黃花百合組培苗保存10個月后，存活率為92%左右，存活的組培苗接種于增殖培養基上，100%正常生長和增殖。綠稈芋莖尖可在MS+ 0.2 mg/L NAA+4 mg/L BA+2 mg/L ABA+20 g/L甘露醇的培養基上，于15℃，100 lx光照的條件下保存350 d，單芽存活率達90%以上，且具良好的生長與恢復分化的能力。以芽的葉柄為外植體，在MS+ 0.2 mg/L NAA+4 mg/L BA培養基中培養，一代繁殖系數可達5.5以上[4]。

除保存技術外，影響種質資源中期保存效果的因素還有外植體類型和生理狀態、保存容器的類型、容積和封口方法等。如適于進行中期保存的外植體類型有愈傷組織、離體小苗、莖尖、莖段、叢芽等，同種植物的外植體類型不同，保存效果也不同[5]，選擇合適的外植體類型進行保存是最重要的。

3 超低溫保存

超低溫保存是指在-80℃以下的超低溫中保存種質資源的一整套生物學技術。超低溫常用的冷源有干冰（-79℃）、深冷冰箱、液氮（-196℃）及液氮蒸汽相（-140℃）。在超低溫條件下保存材料，可以大大減慢甚至終止代謝和衰老過程，保持生物材料的穩定性，最大限度地抑制生理代謝強度，減少遺傳變異的發生。超低溫保存可以克服常溫及低溫保存過程中，由于繼代而產生的遺傳不穩定性，并且還可以減少工作量，減少污染機會等。迄今，不同的植物材料如愈傷組織、胚軸、莖尖、花粉、根尖、休眠芽、原生質體等的超低溫保存都有報道。愈傷組織的超低溫保存相對容易，方法簡單，但由于其再生能力和遺傳的不穩定性，不是理想的種質保存材料。莖尖分生組織由于細胞分化程度小，在植物保存后的再生過程中，比其他細胞培養物的遺傳性穩定，是超低溫保存的一種理想材料。植物細胞內含有大量的水分，低溫冰凍過程會使水結冰，造成細胞結構不可逆轉的破壞，導致死亡。因此，超低溫保存成功與否，關鍵是怎么避免細胞內結冰，使細胞達到玻璃化。現在常用的芽及莖尖分生組織超低溫保存的方法大致有5種。

3.1 慢凍法

通常是以0.5～1.0℃/min的降溫速度，從0℃降到-30～-40℃，隨后浸入液氮，或者以緩慢的速度連續降到-196℃。在有些情況下，在-30～-40℃預凍一段時間，然后才浸入液氮，此方法稱之為兩步冰凍法或分步冰凍法。Brison等采用兩步冰凍方式，保存兩個桃砧木品種離體生長的莖尖，再生率分別為69%和74%。這種方法需要程序降溫器，步驟較為繁雜。

3.2 快凍法

以超過40℃/min的速度降溫，或將材料直接放入液氮或其蒸汽相中。該方法較簡單，不需要復雜昂貴的設備，可使細胞內的水還未來得及形成冰晶，就降到-196℃的安全溫度。到20世紀90年代，傳統的快凍法已被玻璃化法取代。

3.3 玻璃化法

在冰凍前，使用高濃度的冰凍保護劑，即玻璃化液，在25℃或0℃處理一段時間，誘導脫水，然后直接浸入液氮中，此時，冰凍保護劑溶液和保存材料一同進入玻璃化狀態。此方法簡單易行，省時省力，但對植物的毒害較大，較難在同一時間內處理大量的材料。Kobayashi等將臍橙珠心細胞經過一個玻璃化過程后，放入液氮中保存1 a，平均存活率超過90%，通過DNA及形態學檢測顯示遺傳物質及再生的植株形態與保存前都沒有變化。Sakai等[6]將臍橙、葡萄柚等6種植物的珠心細胞通過玻璃化方式，在液氮中保存4個月，存活率也達90%。玻璃化保存的最大難題在于玻璃化冰凍保護劑的化合物組成及配制濃度。

3.4 包埋/脫水法

用藻酸鹽包埋莖尖，在含高濃度蔗糖的培養基中預培養后，在通風櫥中處理2～6 h或用硅膠處理，通過空氣蒸發脫水，然后進行超低溫保存。此方法一次能處理較多材料，避免了使用一些對細胞有毒性的冰凍保護劑，但在一些植物中，成苗率低，與玻璃化法相比，組織恢復生長較慢，脫水所需時間長。Niino等[7]利用包埋/脫水方式在液氮中保存蘋果、梨及桑樹離體生長的莖尖5個月，存活率達80%以上；將這3種材料膠囊化，再經過一個脫水過程（含水量在40%左右），放入-135℃下保存5個月，幾乎都能再生成芽。

3.5 包埋/玻璃化法

Phunchindawan等[8]將辣根芽原基膠囊化后，在0.5 mol/L蔗糖的MS培養基中培養1 d，再用高濃度的玻璃化溶液PVS2脫水4 h，直接放入液氮中保存3 d，69%存活。Matsumoto等將玻璃化與膠囊化方法結合起來，在液氮中保存山葵（莖尖分生組織，也取得了60%以上的存活率。

為了得到較高的超低溫保存成活率，現在的研究多重視對預培養條件的研究。其出發點是為了改變材料的生理狀態，增加細胞分裂與分化的同步化，減少細胞內自由水的含量，增加保護性物質，使其能夠經受起超低溫保存過程中的高度脫水和劇烈的溫度變化等逆境，從而獲得較高的保存成活率。常用的措施有①加入滲透保護物質。在預培養培養基中加入蔗糖[9]、聚乙二醇和二甲基亞砜可以提高成活率。②添加化學成分。預培養時，在培養基中添加ABA，水楊酸等化學成分來誘導材料對低溫的抗性，可以提高保存存活率。③低溫鍛煉。用低溫鍛煉的方法來提高材料的抗凍性，從而提高超低溫保存效率。

綜上所述，植物材料的超低溫保存，要根據材料本身的特性，對影響超低溫保存的因素進行研究，尋找提高超低溫保存成活率和再生率的合理途徑，達到成功保存的目的。

4 展望

離體保存技術由于其具有省時、省地、省空間和無病蟲害侵染等優點，被廣泛應用。我國水生蔬菜資源十分豐富，生態類型也多種多樣，為保存這些特有的水生蔬菜資源，除了進行田間保存，開展離體保存顯得意義重大。目前，國家種質武漢水生蔬菜資源圃已對部分水生蔬菜資源如蓮藕、芋、慈姑、荸薺等的離體保存做了相關研究，雖已取得一定進展，但許多問題尚需進一步探討，如存活率較低，在長期（10 a，20 a，甚至更長時間）保存后，材料的生活力和存活率如何？能否再生植株？另外，離體保存技術在植物育種和生物多樣性保護上的巨大潛力還有待于進一步研究開發。離體保存技術的進一步改進以及保存后植株遺傳穩定性的研究都將是今后植物離體保存的研究重點。相信隨著研究工作的不斷拓展和深入以及技術設施的不斷改進，離體保存技術將日臻成熟，有望在不久的將來得到更廣泛的利用。

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Progress in Techniques for in vitro Preservation of Plant Germplasm Resources

ZHONG Lan,LIU Yuping,PENG Jing

The conservation of plant germplasm resources has extremely vital significance for the biology biodiversity conservation and plant breeding of the new cultivar.The latest advances of techniques for in vitro preservation of plant germplasm resources were summarized.The problems and the perspective of this field were also discussed.

Plant germplasm resource;Preservation;Tissue culture;Cryopreservation

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.16.002

鐘蘭，女，博士，現從事水生蔬菜花卉研究與推廣，電話：027-88116313。E-mail：zhonglanlan_818@sina.com

2009-07-22