抑制性消減雜交技術（SSH）在辣椒抗病基因研究中的應用

肖仲久 李小霞 張素勤 蔣選利

（1.貴州大學農學院，貴陽，550025；2.遵義師范學院生物系）

抑制性消減雜交技術（SSH）在辣椒抗病基因研究中的應用

肖仲久1李小霞2張素勤1蔣選利1

（1.貴州大學農學院，貴陽，550025；2.遵義師范學院生物系）

基于抑制性PCR及差減雜交技術建立的抑制性消減雜交技術，因其假陽性率低、敏感性高、效率高等優點廣泛應用于植物基因差異表達研究。對該技術的原理、主要優缺點及其在辣椒植物抗病性機制研究中的應用進行了綜述。

抑制性消減雜交技術 植物抗病性 辣椒

眾多研究表明，植物的生長、發育、衰老和死亡，組織和細胞的分化、凋亡及變異都與基因的選擇性差異表達有關[1]。因此，分離并克隆差異表達基因被廣泛應用于植物的改良、抗逆、抗病等研究中。目前，基因克隆主要從3個不同的水平上進行研究，即：基因組水平、轉錄水平和蛋白質組水平。由于真核基因組中只有15%的基因得到表達，從轉錄水平進行基因的尋找和分離將會簡化分析背景，使目標序列相對富集，便于克隆和分析[2]。因此，從轉錄水平尋找和分離植物基因是最常用的方法。基于PCR技術基礎上，涌現了許多分離有差別表達基因的方法，比如，mRNA差異顯示技術（mRNA differential display reverse transcription PCR或DD）、代表性差異分析技術（representational difference analysis或RDA）等。但這些技術存在著諸如：假陽性率高、差異基因豐度差別大、步驟繁瑣、工作量大等問題。

而抑制性消減雜交 （suppression subtractive hybridization，SSH）是基于抑制PCR和差減雜交技術建立起來的簡單有效的方法[3]，因其操作簡單、篩選效率高、假陽性率低等優點被廣泛用于生命科學各個領域[4]。

在辣椒生產上，各產區的辣椒生產從播種到收獲均受到不同程度的病害為害。主要有猝倒病、立枯病、灰霉病、白粉病、青枯病、枯萎病、病毒病、晚疫病、炭疽病、瘡痂病及線蟲病等[5]。因此，積極開展病害病因診斷、治療和抗病基因功能與機制的研究是當務之急。目前，從分子水平規模篩選與辣椒病害基因的發生發展機制以及抗病基因的抗病機制密切相關的基因已成為研究熱點。

故本文就SSH技術的基本原理、主要過程及該技術的優缺點等進行簡要介紹，并對其在辣椒抗病基因研究中的應用進展作一綜述。

1 抑制性消減雜交（SSH）技術的主要原理和基本過程

抑制性消減雜交技術（SSH）運用了雜交二級動力學原理，是一種以抑制性PCR反應為基礎，將標準化測試cDNA單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術。在一個循環過程中完成單鏈cDNA豐度的均等化及目標群體和對照群體中相同cDNA序列的去除，從而富集差異表達的基因。整個過程既利用了差減雜交技術的差減富集，又利用了抑制PCR技術的高效動力學富集。

抑制性差減雜交（SSH）經過了兩次差減雜交，兩次抑制性PCR過程。①第一次差減雜交：將含有要分離的差異表達的組織（細胞）作為Tester，對照組織（細胞）作為Driver，分別提取2種不同細胞總RNA，并分離出 mRNA，反轉錄成 cDNA，分別用限制酶消化cDNA，以產生cDNA片段；將Tester cDNA分成均等的兩份，分別接上接頭1和接頭2，然后分別與過量的Driver cDNA變性后退火雜交，第一次雜交后每個樣本中有4種產物：單鏈的Tester cDNA，自身退火的Tester cDNA雙鏈，Tester和Driver的異源雙鏈，自身退火的Driver cDNA。②第二次差減雜交：合并兩份雜交產物，再加上新的變性的Driver單鏈，再次退火雜交，并產生一種新的雙鏈分子，它的兩個5'端有兩個不同的接頭，使其在以后的PCR中被有效地擴增。③第一次PCR：先用DNA聚合酶將cDNA鏈上的接頭上的粘性末端補齊，進行PCR擴增，這時只有兩端分別為接頭1和接頭2的差別表達的序列片段才能以指數形式擴增。④第二次PCR：取第一次PCR擴增產物稀釋后，進行巢式PCR，進一步擴增具有差別表達的序列。最后完成抑制性差文庫的構建。

2 SSH技術在植物抗病基因研究中的應用及其主要優、缺點

2.1 SSH技術在植物抗病基因研究中的應用

早些時候，SSH技術主要集中應用在動物和人的研究上。盡管該方法在植物抗病基因上的研究起步較晚，但自1999年首次應用該方法以來，也已有多篇有關該方法在植物抗病基因研究上應用的報道[6～13]。如近2 a來，黃雪玲等以成株期抗條銹小麥品種興資9104為材料，依照CLONTECH公司PCR-SelectTM cDNASubtraction Kit方法構建了小麥成株期條銹菌誘導的抑制差減雜交cDNA文庫。對文庫中隨機挑取的96個陽性克隆進行測序，對已知序列進行Blastx分析表明，所得基因主要涉及植物的信號傳導、轉錄調控、能量與代謝、蛋白質合成與代謝、膜轉運、細胞生長分化等[14]。于秀梅等利用抑制差減雜交技術構建了條銹菌誘導的小麥葉片cDNA文庫。通過分析抗病相關基因，初步推測HR和SAR可能為小麥抗條銹病過程中的2種抗性形式。最后利用RT-PCR對4條基因進行分析，明確其在抗病過程中的表達模式[15]。張淑珍等研究利用抑制性消減雜交技術成功構建了疫霉菌誘導的大豆抗病品種綏農10差異表達的cDNA消減文庫，從文庫中共篩選到2 067個陽性克隆，利用BLAST在GenBank數據庫中進行序列相似性比對，獲得有功能的EST 375個，分析表明這些EST功能涉及大豆的抑制病原菌生長、細胞自身保護、信號傳導、系統獲得抗性、蛋白質合成、呼吸作用等方面[16]。吳金華等通過小麥種質N9436構建了白粉菌接種初期小麥抗性種質N9436的抑制性消減雜交文庫，得到94條EST，有49條EST與已知功能蛋白同源性較高，主要涉及抗病與防御（包括生物及非生物脅迫）、能量代謝、細胞結構、蛋白質合成及加工、轉運及信號轉導等過程的相關蛋白[17]。

2.2 SSH技術的主要優缺點

眾多的研究表明，該方法最大的優點是降低了假陽性率。其次是具有高度敏感性、速度快、效率高等優點。主要缺點首先是需要較多的原始材料，因為后續研究所需的起始mRNA量較大（一般為幾微克）。消減庫中的cDNA經過RsaI等限制酶消化后，不再是全長cDNA，要想獲得全長序列就要用這些基因片段作為探針從cDNA文庫中篩選出全長基因；但SSH技術不能同時對數個材料之間進行比較，材料之間存在過多的差異及小片段缺失也不能有效被檢測。此外，對植物組織而言，應盡量選擇幼嫩的組織作為研究對象，RNA的分離較動物組織困難，尤其是一些老的植物組織更不易分離出高質量的mRNA。

3 SSH在辣椒抗病基因研究中的應用

較之其他植物，辣椒這方面的研究較少。僅茆振川等以含N基因的辣椒為試驗材料，接種南方根結線蟲 12，24，36 h的根尖材料作為測驗方（Tester），相應的未接種根尖材料作為驅動方（Driver），構建了一個南方根結線蟲誘導N基因表達早期的正向抑制消減雜交cDNA文庫，并結合文庫高密度點陣膜雜交差異篩選，獲得了237條表達序列標簽 （EST）。得到148條功能已知的EST序列，獲得已知的上調抗性相關EST 68個。分離出了具有NBS-LRR結構的抗線蟲蛋白和類LRR抗性蛋白的基因，防御作用相關的類萌芽素（GLP）、HSR203J蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因，抗性相關的WRKY、ERFBP等轉錄因子基因，以及G蛋白、14-3-3蛋白等多種信號蛋白基因[18]。以辣椒雙單倍體HDA149為試驗材料，構建一個南方根結線蟲誘導Me3基因表達早期的抑制消減雜交cDNA文庫，通過高密度點陣膜雜交差異篩選，獲得了309條表達序列標簽（EST）。通過測序，在Gen-Bank上進行BLAST分析，30個EST片段未發現同源性基因，229個為具有同源性的已知基因，其中71個為功能未知的基因[19]。

另外，本課題組正在利用抑制性消減雜交技術進行辣椒對白粉病抗性相關基因的篩選和鑒定研究。通過對供試材料進行接菌、不接菌對照處理，利用抑制性消減雜交技術研究辣椒在白粉菌脅迫下抗性相關基因的差異表達，結合生物信息學手段確定抗性候選基因，并對其進行分離、克隆和功能性研究，進一步闡述辣椒對白粉病的抗性機制，為培育抗辣椒白粉病新品種奠定基礎。

本課題組正在利用抑制性消減雜交技術進行辣椒對白粉病抗性相關基因進行篩選和鑒定，擬構建辣椒在白粉菌脅迫下抑制性消減雜交文庫，研究辣椒在白粉菌脅迫下抗性相關基因的差異表達。

4 展望

辣椒因其營養豐富、味道鮮美而在世界各地廣泛種植，在我國各地均有栽培，并已成為農民致富的重要經濟作物之一。我國辣椒種植面積廣，但由于各地環境條件相差比較大，辣椒病害種類多且為害嚴重，已成為我國辣椒生產的主要障礙。長期以來，主要依賴化學藥劑和種植抗性品種來控制病害。但化學農藥的濫用不僅加大了生產成本、給環境帶來污染，同時也加速了病原菌毒力的變化。而常規育種通常所需的時間很長及新育成的品種由于病原菌的群體毒性變化而喪失抗性。因此，嘗試結合功能基因組和生物信息學研究的方法和技術進行抗病相關基因的研究，深入研究植物的抗病性、病原菌的致病性以及植物與病原菌的相互關系，并探索其他可能的抗病途徑，才能從根本上解決植物病害問題，同時為抗病育種研究帶來新的啟示[20]。SSH技術正廣泛應用于該領域，SSH技術的進一步改進和提高，將有助于該技術在植物基因的分離、克隆及抗病相關基因的表達調控等方面發揮更顯著的作用。

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Application of SSH to Disease-resistance Gene Expression of Pepper

XIAO Zhongjiu1,LI Xiaoxia2,ZHANG Suqin1,JIANG Xuanli1
(1.Academy of Agriculture,Guizhou University,Guizhou 550025;2.Department of Biology,Zunyi Normal College)

The suppression subtractive hybridization (SSH)based on suppression PCR and subtractive technique,with the advantage of low false positives,high sensibility,high efficiency,and so on is widely used in the differential expression of plant gene.The principle,relative merits and demerits of SSH were reviewed.The application to the research of pepper disease-resistance mechanism was summarized.

Suppression subtractive hybridization(SSH);Plant disease-resistance;Pepper

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.12.001

貴州省科學技術基金（黔科合J字[2009]2104號）；貴州省科學技術基金（黔科合J字（2006）2052號）；遵義市科技計劃基金項目（遵市科合社字[2009]22號）；貴州大學人才科研基金：辣椒抗白粉病的分子細胞學研究

肖仲久（1980-），男，講師，在讀博士，主要從事植物免疫學及分子病理學研究，電話：13765047925。E-mail：xzj198099@163.com

蔣選利，通信作者。電話：13985471856

2008-12-24