微型薯多酚氧化酶的特性研究

謝奎忠 陸立銀

（甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州，730070）

微型薯多酚氧化酶的特性研究

謝奎忠 陸立銀

（甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州，730070）

對(duì)分離純化后的微型薯的多酚氧化酶性質(zhì)進(jìn)行研究，以鄰苯二酚為作用底物，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 420 nm處測(cè)定不同 pH值、反應(yīng)溫度、底物條件下微型薯的多酚氧化酶（PPO）活性，以討論微型薯的褐變機(jī)理。結(jié)果表明，微型薯的 PPO最適 pH值 約為 5.5，最適反應(yīng)溫度為 35℃左右，該酶熱穩(wěn)定性差；最適作用底物為綠原酸、原兒茶酸和咖啡酸；FeSO4和抗壞血酸等化合物可以抑制 PPO活性，CaCl2和CuSO4等則起促進(jìn)作用。適度高溫、強(qiáng)酸性或堿性條件、FeSO4或抗壞血酸等處理都可以抑制該酶活性。

微型薯 多酚氧化酶 酶學(xué)性質(zhì)

隨著我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，脫毒微型薯在種薯中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛；因此，微型薯的貯藏問(wèn)題越來(lái)越突出，儲(chǔ)藏條件與微型薯的腐爛率、出苗率以及長(zhǎng)勢(shì)密切相關(guān)。多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一種含銅酶，它能夠催化酚類物質(zhì)變成醌[1～2]。近幾十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)植物組織的褐變研究表明，組織的褐變主要是由于PPO活性引起的。有關(guān)馬鈴薯PPO的研究早有報(bào)道，如PPO活性在不同組織中的表現(xiàn)，有機(jī)酸對(duì)組織中PPO活性的影響[3～4]，貯藏溫度、pH值對(duì)馬鈴薯PPO活性的影響[5]。但是，目前對(duì)微型薯中的 PPO特性研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)微型薯經(jīng)分離純化后的酶學(xué)特性等進(jìn)行研究，以明確該酶性質(zhì)，為控制微型薯在貯藏過(guò)程中褐變提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將分離純化后的甘農(nóng)薯1號(hào)微型薯薯肉 66 kD的PPO作為酶反應(yīng)液，研究其酶學(xué)性質(zhì)。分離純化參考林敏等[6]的方法進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

①PPO活性 PPO活性測(cè)定參考Zauberman等[7]方法進(jìn)行。把0.5 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚加入1.95 mL 50 mmol/L pH值6.8的磷酸緩沖液中，在38℃下保溫10 min后，加入0.1 mL酶粗提液，于波長(zhǎng)420 nm下測(cè)定OD值變化，每隔 1 min記錄1次，共記錄10 min。以每分鐘 OD420變化 0.01為一個(gè)PPO酶活性單位。

②PPO最適 pH值 酶反應(yīng)液組成和酶活性測(cè)定條件同上，配制不同pH值 的 0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液按照 Fujita等[8]的方法進(jìn)行。

③PPO的最適反應(yīng)溫度和對(duì)溫度的穩(wěn)定性PPO最適反應(yīng)溫度測(cè)定采用 Zhou等[9]的方法進(jìn)行。將1 mL 100 mmol/L的鄰苯二酚、1.95 mL 0.1 mol/L pH值 6.8的磷酸緩沖液和 0.1 mL酶液混合液在不同溫度（20～50℃，間隔溫度為5℃）水浴中分別保溫10 min，加入20%三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)，冷卻至室溫（18.5℃），在分光光度計(jì) 420 nm處測(cè)定光密度。PPO熱穩(wěn)定性測(cè)定是先將0.1 mL酶液與3.9 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液混合，分別在不同溫度水浴中保溫10，20，30 min，然后在冰浴中迅速冷卻5 min。當(dāng)混合液溫度達(dá)到室溫（18.5℃）時(shí)，加入1 mL 100 mmol/L鄰苯二酚。之后按①的方法測(cè)定殘余酶的吸收值的變化。

④底物濃度對(duì) PPO活性的影響 用 pH值6.8的0.2 mol/L磷酸氫二鈉-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制鄰苯二酚溶液。向裝有5 mL鄰苯二酚溶液（1～50 μmol/L）的比色杯中加入1 mL酶液，在分光光度計(jì)420 nm處測(cè)定PPO吸收值變化，并計(jì)算酶活力。

⑤酶底物專一性 按照 Wong等[10]的方法測(cè)定。PPO反應(yīng)系統(tǒng)含0.05 mL酶液和2.95 mL不同底物溶液（沒(méi)食子酸、綠原酸、原兒茶酸、香豆酸、咖啡酸和阿魏酸等，使用 0.1 mol/L磷酸緩沖液調(diào)配，其中阿魏酸先用微量異丙醇溶解）。經(jīng) 38℃保溫10 min后，加入 20%三氯乙酸 1 mL終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用分光光度計(jì)對(duì) 200～500 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，確定特征吸收波長(zhǎng)，在特征吸收波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值的變化。

⑥不同化合物對(duì)PPO活性的影響 將0.5 mL 0.1 mol/L的鄰苯二酚與 1.85 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液和0.1 mL不同化合物溶液（CaCl2，CuSO4，EDTA，F(xiàn)eSO4，NaCl和抗壞血酸等，濃度均為1 mmol/L）均勻混合后，立即加入 0.05 mL酶液，用分光光度計(jì)在420 nm處測(cè)定 PPO吸收值變化，計(jì)算酶活力。酶活性大小以無(wú)化合物時(shí)酶活性百分比表示。

圖1 pH值 對(duì)微型薯多酚氧化酶活性的影響

圖2 溫度對(duì)微型薯多酚氧化酶活性的影響

圖3 微型薯多酚氧化酶對(duì)熱的穩(wěn)定性

圖 4 底物濃度對(duì)多酚氧化酶活性的影響

表1 微型薯多酚氧化酶底物的專一性

表2 不同化合物對(duì)微型薯多酚氧化酶活性的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 PPO最適反應(yīng)pH值

以鄰苯二酚為底物，微型薯66 kD的PPO最適pH值為5.5（圖1）。當(dāng)pH值低于3.0時(shí)，PPO不表現(xiàn)出活性。當(dāng)pH值 大于5.5時(shí)，PPO活性迅速下降。

2.2 PPO最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

從溫度對(duì) PPO活性的影響（圖 2）可以看出，微型薯PPO的最適反應(yīng)溫度為35℃。在此溫度下，酶的相對(duì)活性為94%。當(dāng)溫度超過(guò)40℃時(shí)，PPO活性急劇降低，微型薯PPO不耐高溫。

由圖3可以看出，微型薯 PPO的熱穩(wěn)定性較差。在30℃熱處理30 min，酶活性僅損失36%；但當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，PPO活性損失較大。45℃處理10 min，PPO的活性損失達(dá)50%。在50℃下，保溫30 min，PPO的活性損失達(dá)80%，該酶基本上失去活性。

2.3 底物濃度對(duì)PPO活性的影響

從圖4底物濃度對(duì)PPO活性的影響可以看出，當(dāng)?shù)孜镟彵蕉訚舛鹊陀?0 mmol/L時(shí)，底物濃度與PPO活性成正比，但當(dāng)濃度高于40 mmol/L時(shí)，反應(yīng)速度開(kāi)始下降；這可能是由于產(chǎn)物的積累抑制了PPO的活力。

2.4 PPO對(duì)底物的專一性

分別對(duì)微型薯肉PPO與不同種類的游離酚酸底物作用后的產(chǎn)物進(jìn)行 200～500 nm掃描，確定特征吸收波長(zhǎng)。從表 1可以看出，以作用于沒(méi)食子酸的活力為100%計(jì)算，綠原酸的相對(duì)活力最大為324.3，是沒(méi)食子酸活力的3倍；其次為原兒茶酸226.0，是沒(méi)食子酸活力的2.6倍；咖啡酸的活力為132.0，是沒(méi)食子酸活性的1.3倍；香豆酸、阿魏酸的相對(duì)活力小于100%。所以微型薯66 kD的PPO的最適作用底物為綠原酸、原兒茶酸和咖啡酸。

2.5 不同化合物對(duì)PPO活性的影響

不同化合物對(duì)微型薯PPO活性的影響如表 2所示。在這些化合物中，以 FeSO4的抑制效果最好，其次是抗壞血酸。CaCl2和CuSO4能夠不同程度地促進(jìn)PPO的活性。

3 小結(jié)

微型薯PPO的最適pH值約為5.5；最適反應(yīng)溫度為 35℃左右，熱處理的穩(wěn)定性差；最適反應(yīng)底物為綠原酸、原兒茶酸和咖啡酸；FeSO4、抗壞血酸和 EDTA可以抑制 PPO活性，而CaCl2、和CuSO4則起促進(jìn)作用。該酶耐熱能力差，適度高溫、強(qiáng)酸性和堿性條件、FeSO4和抗壞血酸處理均可以抑制該酶活性。

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Study of Polyphenol Oxidase in Min-tuber Potato

XIE Kuizhong，LU Liyin
(Potato Research Institute,Gansu Academy of Agricultural Sicence,Lanzhou 730070)

Properties of polyphenol oxidase extracted and purified from min-tubers potato were studied to investigate the theory of browning.Polyphenol oxidase activities were spectrophotometrically determined at 420 nm with catechol as substrate at different pH,temperatures and substrate concentrations and so on.The optimum pH for PPO activity was 5.5 with catechol as substrate.The enzyme was relatively stable at low temperature,with the maximum activity was observed at 35℃.Chlorogenic acid,Protocatechuic acid,and Caffeic acid were good substrates for the enzyme.FeSO4and ascorbic acid markedly inhibited PPO activity,whereas CaCl2and CuSO4enhanced the activity.PPO of min-tuber potato was stable at low temperature,high temperature,high pH and ascorbic acid can inhibited the activities of the enzyme.

Min-tubers potato;Polyphenol oxidase;Enzymatic properties

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.01.012

甘肅省科技廳重大專項(xiàng)“貯藏保鮮技術(shù)與設(shè)施產(chǎn)業(yè)化示范”的子課題“馬鈴薯貯藏條件設(shè)施技術(shù)改造”項(xiàng)目(0702NKDA035)；甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院自列項(xiàng)目資助。

謝奎忠（1979-），男,碩士，主要從事馬鈴薯生理生態(tài)與栽培技術(shù)的研究工作，電話：0931-7614641。E-mail：xiekz@yahoo.com.cn

2008-11-21