結核分支桿菌耐藥基因的雜交檢測

韓中波　周亞麗

【摘要】 目的 采用PCR-反向斑點雜交檢測結核分支桿菌中rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突變。評價該方法檢測結核分支桿菌利福平(RFP)、異煙肼(INH)和鏈霉素耐藥性，探討直接檢測結核患者痰標本的可行性。方法 用PCR-反向斑點雜交技術分析對75株臨床分離株和45例肺結核患者涂陽痰標本進行rpoB、rpsL和KatG基因突變的檢測。結果 臨床耐藥株分離株進行rpoB、rpsL和KatG基因突變的檢測，其突變率分別為83．9％、62．5％、57．1％。肺結核患者涂陽痰標本中耐藥株突變率分別為81．0％、60．0％、52．9％。結論 rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突變與結核分支桿菌耐利福平、異煙肼和鏈霉素密切相關，應用PCR-反向斑點雜交技術可快速檢測結核分支桿菌對異煙肼、鏈霉素和利福平耐藥性。PCR-反向斑點雜交技術有望成為結核分支桿菌耐藥性檢測的重要方法之一。

【關鍵詞】結核分支桿菌；反向斑點雜交；藥物耐受性

近年來全球結核病呈現死灰復燃的趨勢，其主要原因是耐藥(DR-TB)和耐多藥(MDR-TB)結核病的廣泛分布和迅速傳播。異煙肼(INH)、鏈霉素(SM)、利福平（RFP）作為結核病治療中最主要的一線抗結核藥物，對其耐藥性的研究日益受到重視。傳統的結核分支桿菌耐藥性測定由于需要6～8周時間，不能及時指導臨床用藥。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，對結核菌的耐藥機制有了進一步認識，認為結核分支桿菌耐異煙肼的產生是過氧化氫酶－過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關，也inhA基因突變也有相關性；耐鏈霉素的產生是由于其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL和16SrRNA的編碼基因rrs的缺失和突變所導致；結核分支桿菌耐RFP與其核心區域rpoB基因突變有關^[1、2]。筆者采用采用PCR－反向斑點雜交技術分別對肺結核患者痰標本臨床分離株和結核患者痰標本直接進行KatG基因、rpsL基因、rpoB基因的突變檢測，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1．1 標本來源 75株臨床分離株和45例肺結核患者涂陽痰標本均來自吉林市結核病防治研究所，其中31例耐RFP，28例耐INH，24例耐SM。 45例肺結核患者涂陽痰標本按結核病診斷細菌學規程進行菌種鑒定及藥敏實驗證實為結核分支桿菌，其中21例耐RFP，17例耐INH，20例耐SM。

1．2 細菌DNA的制備^[3]臨床分離株DNA用常規酚／氯仿抽提法提取標本中DNA。

1．3 PCR擴增 采用25 ul反應體系，4×dNTPs終濃度為0．2 mmol／L，Bio-標記引物終濃度為0．2 umol／L，擴增程序為：94℃變性I min，58℃退火1 min，72℃延伸I min，循環30次，最后72℃延伸10 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外檢測出現267 bp條帶。

1．4 雜交檢測 將點有探針的硝酸纖維素膜裝入雜交袋中，加入雜交液放置水浴鍋中進行預雜交：45℃×30 min。將Bio-標記引物的PCR擴增陽性產物變性：95 ℃×l0 min，取出迅速放入冰盒中，每ml雜交液一般加 l0ul變性的擴增產物，放置水浴鍋中進行雜交：45℃×30 min。洗膜：洗液1 、45℃× 3 min，洗液2 、45℃×3 min。SA-AP：用l：1000的稀釋液(洗液I)與膜在37℃作用30 min。洗膜：洗液I、45℃× 3 min，洗液II 、45℃×3 min。顯色：每毫升洗液I加入NBT 6．6ul、BICP 3．3ul混勻，將配好的顯色液加入雜交袋中，閉光37℃顯色5 min，觀察結果

2 結果

應用PCR-反相斑點雜交技術檢測rpoB、rpsL和KatG基因突變結果（見表1、2）。75株臨床分離株進行rpoB、rpsL和KatG基因突變的檢測，PCR擴增均為陽性，其耐藥株突變率分別為83．9％、62．5％、57．1％，其敏感株突變率分別為0、0、2．1％。

45例肺結核患者涂陽痰標本進行rpoB、rpsL和KatG基因突變的檢測，其耐藥株突變率分別為81．0％、60．0％、52．9％, 其敏感株突變率分別為0、4．1%、3．7％。

3 討論

目前，結核分支桿菌耐藥性測定仍多采用絕對濃度法、比例法等經典方法。但由于結核分支桿菌生長緩慢，而耐藥結核分支桿菌生長更為緩慢，其耐藥性測定需6～8周甚至更長，不能及時指導臨床用藥。Bactec結核培養系統因其價格昂貴等諸多不便限制了其廣泛使用。近年來，隨著分子生物學的不斷發展已研究發現結核分支桿菌耐RFP與其核心區域rpoB基因突變有關，結核分支桿菌耐異煙肼的產生是過氧化氫酶－過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關，也inhA基因突變也有相關性；耐鏈霉素的產生是由于其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL和16SrRNA的編碼基因rrs的缺失和突變所導致。

本實驗室前期通過PCR-SSCP方法得出耐異煙肼時，KatG基因突變率為63．1%，耐鏈霉素時，rpsL基因突變率為72．2%，耐利福平時，rpoB基因突變率為90．1%^[3]。但PCR-SSCP方法建立在凝膠電泳基礎上，難于標準化和質量控制，難以大規模推廣。通過對KatG、inhA、rpsL、rrs基因核心易變區進行DNA序列分析。根據基因突變的中心區域，設計靶基因，制備寡核苷酸探針，點樣在雜交膜上，進行PCR－寡核苷酸探針反相斑點雜交。

PCR-反相斑點雜交檢測臨床分離株rpoB、rpsL和KatG基因突變，耐藥株的rpoB、rpsL和KatG基因突變率分別為83．9％、62．5％、57．1％，這與一些報道相近^[4]。還有2．1%的敏感株KatG基因發生突變，原因有待于進一步探討。PCR－反向斑點雜交技術直接檢測了54例肺結核患者痰標本，耐藥株突變率分別為81．0％、60．0％、52．9％。突變率略低于其臨床分離株。這可能是由于痰標本雜質多，同時痰標本的處理和靶DNA濃度對PCR擴增有直接影響。PCR－反向斑點雜交技術以其簡便、快速、靈敏并可以直接檢測未經培養的痰標本中結核分支桿菌rpoB、rpsL和KatG基因突變，可在2 d內出結果，從而彌補了常規藥敏實驗的不足，有望成為臨床耐藥性測定的重要手段之一。

參考文獻

［1］ Williams D, Waguespack C, et al. Characterization of rifampin in pathogenic Mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother, 1994, 38: 2380-2386.

［2］ Morris S, Bai GH, et al .Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis ,JID,1995,171:805.

［3］ 張永勝，李書琳，張小剛，等.結核分支桿菌耐異煙肼分子機制的研究.中國醫師雜志， 2002，4(4)：374-375.

［4］ 莊玉輝，何秀云，張小剛，等.耐利福平結核分支桿菌耐藥分子機制的研究. 中華結核和呼吸雜志，2000，23：711-714.